胎儿游离DNA在产前诊断中的应用

孔令霞，陈先侠

随着国家二胎政策的全面放开，生育人数明显增加，其中高龄产妇更是逐年增加。随着孕妇人数及妊娠年龄等方面的增长，各种胎儿疾病如唐氏综合征、爱德华综合征和帕托综合征等染色体非整倍体疾病的发病率也随之增加。自1997年在孕妇外周血中发现胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA)以来[1]，无创产前检测便开始逐渐取代传统的血清生化标志物筛查[2]以进行产前诊断[3]。随着新一代基因测序技术的不断发展，使得cffDNA在妊娠早期产前诊断的筛查中得到广泛应用。本文就孕妇外周血cffDNA在产前诊断中的应用与发展进行综述。

1 孕妇外周血中cffDNA的发现与来源

1.1cffDNA的发现 1969年Walknowska等[4]研究表明胎儿淋巴细胞的母体转移很常见，可以通过母体血液中淋巴细胞的核型分析来进行男性胎儿的产前诊断，同时也可以识别胎儿染色体异常。1997年Lo等[1]通过PCR技术检测出怀有男性胎儿的孕妇血清和血浆中均有男性胎儿Y染色体DNA序列，同时cffDNA的含量与孕周密切相关，最早可在妊娠第5周通过定量PCR技术在母体外周血中检测出cffDNA，并在妊娠第7周与母体建立完整的胎盘循环，其含量随孕周的增加而增加，这一发现为孕妇外周血中cffDNA作为产前检测手段提供了重要依据，也为产前诊断开辟了新途径。

1.2cffDNA的来源与获取 cffDNA是一段双链且高度片段化的DNA片段，大多数分子长度约为150 bp。虽然临床研究证明孕妇外周血中存在cffDNA，但其来源目前尚不明确，推测有下列几种可能：①来源于胎盘通道：游离的胎儿细胞通过胎盘通道渗透到母体血液当中，被母体免疫系统破坏，最终导致胎儿DNA残留[1]；②来源于凋亡的胎儿细胞：胎儿细胞凋亡后降解、释放出来的DNA通过直接跨膜转运的方式转运到母体外周血中[5]，并且以两种形式存在于母体血液循环中，一种是以完整细胞的形式存在，另一种则是以cffDNA的形式存在；③来源于胎盘滋养层细胞：胎盘是连接胎儿与母体的直接通道，胎盘滋养层细胞的释放与脱落是孕妇外周血中cffDNA出现的主要原因，其含量与孕周有关，并在分娩后2 h即从母体中消失。cffDNA的检测和发现使得无创产前诊断得到了进一步的发展，但在临床运用过程中仍面临很大的挑战，主要原因是cffDNA与母体DNA存在50%的共有序列[6]，而且母体外周血中的胎儿细胞包括滋养层细胞、淋巴细胞、粒细胞、造血干细胞和胎儿有核红细胞等大量细胞，同时还存在嵌合细胞，使得滋养层细胞的含量很少，只有1%左右的滋养层细胞来源于母体[7]。在妊娠阶段，cffDNA占母体血浆中总循环游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)的3%～13%[8]，若孕周小于12周时，cffDNA在孕妇外周血中的含量则较低，常低于4%，可能会导致无法检测或者出现假阴性[9]。因此，提高胎儿DNA在孕妇外周血中所占比例是评估无创产前检测技术(non-invasive prenatal testing， NIPT)检测准确性的重要参数。Jorgez和Bischoff[10]通过DNA分子长度分级分离法和全基因组扩增法来提高cffDNA的富集效率，进而降低母体cfDNA比例来提高NIPT检测结果的准确性。

2 cffDNA在产前诊断中的应用与发展

NIPT主要通过对孕妇血浆中的cffDNA进行测序来鉴定胎儿非整倍体疾病[11]，主要通过采集孕妇外周静脉血，利用新一代DNA测序技术对孕妇外周血浆中的cfDNA片段进行测序，进而确定DNA片段及其染色体，再通过计算每一条目标染色体的片段数目，确定其是否较预期的cfDNA数量增加或减少，进而计算染色体序列数目比率，从而检测胎儿是否患有唐氏综合征、爱德华综合征和帕托综合征等染色体异常疾病[12]。

在cffDNA应用于产前诊断之前，妊娠早期主要通过血清生化标志物和产前超声标记联合检测胎儿非整倍染色体疾病。血清生化标志物筛查原理是胎儿染色体如果发生异常可影响胎盘功能，从而导致孕妇出现胎盘分泌的相应血清生化指标异常。Christiansen等[2]研究发现，在妊娠第9～13周，与妊娠相关的血浆蛋白A水平下降、人绒毛膜促性腺激素β亚单位(human chorionic gonadotropin beta subunit, β-HCG)水平增高的孕妇存在唐氏综合征的发生风险。虽然通过血浆蛋白A、游离β-HCG和胎儿颈项透明层(nuchal translucency， NT)的联合筛查可诊断约90%的唐氏综合征胎儿，假阳性率约5%[13]，并且对爱德华综合征和帕托综合征也有一定的筛查作用，但是该方法灵敏度有限，且无法对胎儿进行遗传疾病检测。

2.1在染色体非整倍体疾病方面的应用 1997年Lo等[1]在孕妇外周血中发现男性胎儿Y染色体特异性DNA片段，为cffDNA用于胎儿染色体非整倍体疾病的筛查提供了可能。1999年Lo等[14]通过定量PCR技术检测出cffDNA的异常增高与胎儿唐氏综合征有关，进而提出是否可以利用cffDNA水平变化作为产前检测唐氏综合征的标志物。有学者运用这一特性通过多重定量PCR技术对胎儿进行染色体非整倍体疾病的相关检测[15]。随着分子生物学技术的不断发展及新一代高通量基因测序技术的出现，发现NIPT可以通过对cffDNA进行测序，进而对胎儿染色体非整倍体疾病进行筛查，并且cffDNA检测能更早发现胎儿染色体异常，较传统的产前诊断方法具有更高的的灵敏度和特异度[16]。

目前NIPT主要筛查高危孕妇的染色体非整倍体异常，对唐氏综合征、爱德华综合征和帕托综合征这三大染色体疾病具有十分重要的意义，尤其是唐氏综合征的检出率可高达99%，假阳性率仅为0.13%[17]。

2.2在染色体微缺失疾病方面的应用 目前cffDNA已广泛应用于无创性产前诊断，并不断发展形成了NIPT升级版(NIPT-plus)，该技术是在NIPT常规应用cffDNA检测13号、18号、21号等染色体非整倍体疾病的基础上，以全基因平行测序技术为基础，主要用于5号、9号、16号染色体及性染色体异常等相关疾病的检测和筛查，同时还可检测15q11-q13、5p15.2-15.3、22q11.2、1p36及4p16.3等常见的染色体微缺失疾病[18]，而这种染色体缺失通过常规染色体检测方法不易检测，NIPT-plus技术的发展为其提供了可能。

2.3在基因遗传性疾病方面的应用 近年cffDNA逐渐应用于基因遗传性疾病的检测，通过DNA测序技术，分析父母亲基因组的单倍型并鉴定致病基因位点周围的单核苷酸多态性，再对母体外周血浆中cffDNA进行测序和相对单倍型剂量分析，进而推测胎儿的突变状态。目前cffDNA已成功检测如杜氏肌营养不良[19]、脊髓性肌萎缩[20]、β-地中海贫血[21]、先天性肾上腺皮质增生[22]及枫糖尿病[23]等基因遗传性疾病。

2.4在胎儿RhD血型检测方面的应用 若红细胞缺乏D抗原，临床称为Rh阴性，而具有D抗原时则称为Rh阳性。若血型为Rh阴性的母亲再次妊娠血型为Rh阳性的胎儿时，妊娠期间可有少量胎儿血液进入母体的血液循环，进而产生大量IgG抗体，该抗体通过胎盘屏障引起胎儿溶血，导致新生儿溶血性疾病的发生[24]，出现黄疸、贫血、肝脾增大等严重的临床表现，重者出生后即有严重贫血、胎儿水肿及心力衰竭等临床表现。通过检测cffDNA，在妊娠中晚期便可检测出胎儿RhD血型，进而利用孕妇外周血中cffDNA对胎儿进行RhD基因分型，争取对新生儿溶血性疾病的发生做到早发现、早预防和早治疗。

2.5在女性相关癌症方面的应用 有文献报道，几乎所有的癌症都有体细胞基因改变，而这种体细胞基因改变可以通过循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)反映出来，而ctDNA是来源于肿瘤患者血液中的无细胞DNA部分[25]。cfDNA的改变往往会导致NIPT的检测结果与胎儿检测结果不一致，当出现NIPT与最终诊断结果不一致时，接诊医师要想到母体患有恶性肿瘤的可能，此时母体外周血中cfDNA更多的是来源于母体癌细胞，而不是胎儿细胞。

Ji等[26]通过研究证明了运用cffDNA检测恶性肿瘤的可能，使得NIPT在拷贝数变异(copy number variations， CNVs)方面有着广阔的应用前景，并且CNVs在ctDNA中的表征可作为肿瘤生物标志物。因此，利用NIPT可以推测女性癌症的预后和复发情况。低覆盖率全基因组测序的NIPT平台能够有效识别早期和晚期女性癌症，并能预测预后，尤其是在女性卵巢癌、乳腺癌及子宫内膜癌晚期阶段中的预测效果更好[27]，为检测孕妇相关癌症提供了可能，也为术后癌症的复发提供了理论依据。

2.6在多胎妊娠方面的应用 随着辅助生殖技术的迅速发展，其在解决了女性不孕不育的同时也使多胎妊娠的发生率逐渐升高，其中双胎妊娠最常见。与单胎妊娠相比，多胎妊娠的相关妊娠疾病发病率增加，常规的产前筛查对于双胎妊娠的检测准确率远远低于单胎妊娠，而侵入性产前检查又会使流产和感染的发生风险增加。有文献报道，cffDNA检测能在避免侵入性操作的同时对双胎妊娠进行有效的产前筛查[28]。有研究表明双胎非整倍体阳性发生率为1.9%～8.1%[29]。Yu等[30]发现NIPT对于双胎妊娠产前筛查的准确性和特异度高达100%，更加证实了cffDNA可有效应用于多胎妊娠的产前筛查。

3 cffDNA应用于产前诊断中的优势与局限性

3.1cffDNA在产前诊断中的优势 传统的有创性产前检查方法主要通过侵入性操作对胎儿进行染色体等相关疾病的检测，如胎儿脐带血取样、羊膜穿刺和绒毛膜绒毛取样等[31]。然而，侵入性产前检查使流产发生率升高，早产和胎膜早破等发生风险也随之增加[6]。NIPT通过检测孕妇外周血中cffDNA，有效避免了有创性检查对孕妇及胎儿所造成的侵入性损害，使孕妇流产和感染的发生风险降低，而且操作更加简便，安全性也相对较高，更易被孕妇所接受。

NIPT作为一种产前筛查方法，能够有效检测出染色体非整倍体疾病，对于胎儿染色体疾病的筛查和预防有着非常重要的作用，同时cffDNA与母体血清生化标志物筛查相比，具有准确率更高、假阳性率更低的特点，尤其是对于唐氏综合征、爱德华综合征和帕托综合征这三大染色体疾病的筛查具有较高的灵敏度和准确性。Taylor-Phillips等[32]研究表明NIPT在运用孕妇外周血中cffDNA检测胎儿染色体非整倍体疾病方面准确性高，其中唐氏综合征、爱德华综合征和帕托综合征的诊断准确率分别高达99.3%、97.4%和97.4%。

3.2cffDNA应用于产前诊断的局限性 孕妇外周血中cffDNA对于染色体非整倍体疾病的检测主要受到以下因素的影响：①cffDNA在孕妇外周血中含量较少，尤其是孕周小于12周时，cffDNA在孕妇外周血中的含量常低于4%，可能出现cffDNA无法检测或者出现假阴性[12]，这也是NIPT多在妊娠12～26+6周进行的原因[33]；②cffDNA来源于胎盘DNA，而非胚胎本身DNA，同时与母体DNA存在50%的共有序列[9]，故部分假阳性或假阴性结果的出现也是不可避免；③目前cffDNA主要应用于唐氏综合征、爱德华综合征和帕托综合征等染色体非整倍体疾病的筛查，准确性较高，但是筛查的染色体范围有一定局限性，且当孕妇出现多胎、嵌合体及父母亲中存在染色体异常等情况时则不适于采用cffDNA进行产前筛查。

虽然孕妇外周血中cffDNA在产前诊断中的应用存在一定的局限性，但是其作为一种产前筛查方法能够有效检测出染色体非整倍体疾病，对于胎儿染色体疾病的筛查和预防有着非常重要的作用，且在保证灵敏度和特异度的同时也能降低流产和感染的发生率，是一种无创、早期、安全的产前筛查方法，易被孕妇所接受，可广泛应用于临床产前检测。