染色体微阵列分析技术在产前诊断中的研究进展

江梅花，陈先侠

早在20世纪70年代染色体G显带核型分析就已成为检测胎儿染色体异常的金标准[1]，可以检测3～10 Mb的大量非整倍体的重复、缺失及结构重排[2]，但细胞培养周期长(10～14 d)、制片过程复杂,并且对结果的解读多依赖于主观经验[3]，不能发现亚显微的缺失和重复。随着染色体分析技术的发展，1969年Pardue和Gall[4]提出荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH),其不需要细胞培养，能快速检测和定位染色体特定DNA序列的插入或缺失，是细胞遗传学和分子生物学的第一次融合，为产前诊断学的发展提供了强大动力。然而，FISH只针对特定的染色体区域，一次只能检测一个染色体位点(如微缺失综合征)或多个候选染色体位点(如亚端粒区域)。多重连接探针扩增、定量荧光PCR 和细菌人工染色体微珠技术的引入弥补了FISH技术的不足，可以快速检测更多位点的染色体非整倍体和基因的微缺失、微重复，大大缩短了产前诊断的时间，同时也提高了染色体不平衡的检出率，但遗憾的是只能检测某一区域的基因序列，不能在全基因组范围内检测染色体的不平衡。

染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis, CMA)可检测全基因组的微缺失和微重复而应用于临床，主要作为对患有多种先天性异常、发育迟缓、智力残疾和自闭症谱系障碍的儿童进行出生后细胞遗传学初步评估的第一层测试[5]，因其具有高通量、自动化程序高、分辨率高等优点，自2008年起CMA开始从“产后”走向“产前”[6]。前瞻性队列研究表明，在核型分析结果正常而超声提示结构异常和其他存在高危指征的孕妇中，CMA能够分别额外发现6%和1.7%的临床相关拷贝数变异(copy number variations, CNVs)[7]，故2013年美国妇产科医师大会和母胎医学学会建议将CMA作为对有重大结构异常的胎儿进行细胞遗传学评估的第一层测试[8]。最新指南推荐，当发现胎儿畸形或颈项透明层(nuchal translucency, NT)≥3.5 mm时，应在快速非整倍体检测后实施CMA，但后续结果需要由CMA专业人员给予遗传咨询[9]。

1 CMA概述

CMA也称分子核型分析技术，通过检测DNA的CNVs来诊断染色体异常。根据探针的设计原理不同，CMA分为比较基因组杂交微阵列(comparative genomic hybridization array, aCGH)和单核苷酸多态性微阵列(single nucleotide polymorphism arrays， SNP arrays)。

aCGH最初应用于癌症领域[10]，即将患者和对照样本的DNA进行不同的荧光标记，并与芯片上的互补探针杂交，再利用荧光染料不同颜色的强度绘图，通过患者与对照样本的DNA异常比率显示CNVs。通过差异杂交信号aCGH可以检测整个基因组中3～10 Mb分辨率的不平衡染色体重排[3]，但因分辨率低和技术挑战限制了临床推广。2006年Rickman等[11]用目标DNA代替中期染色体，用金属针或毛细玻璃管代替普通玻片，成功地在未培养的羊膜细胞上进行了aCGH研究，简化了分析过程且缩短了周转时间，进而显著提高了分辨率。不同的aCGH分辨率取决于DNA探针的间距和长度，靶向微阵列主要用于检测非整倍体、特征良好的微缺失和(或)微重复综合征、亚端粒或其他不平衡染色体重排，以提高具有可变表型或外显率的不确定临床意义的变异(variant of uncertain significance， VOUS)或拷贝数变异(copy number variation， CNV)的检测率。然而，aCGH可能会在缺乏探针覆盖的基因组区域内错过潜在的具有重大临床意义的CNV。此外，少量芯片为全基因组aCGH，因其探针可覆盖整个基因组，因此能够检测出高分辨率的CNVs，同时VOUS的检出率也大大增加，临床使用时要考虑CMA平台及其局限性。

SNP arrays主要使用由短序列(25～60 bp)核苷酸组成的单核苷酸探针，通过确定数百万多态位点的基因型以识别缺失或重复的DNA片段。与aCGH相比，SNP arrays不需要参考样本即可确定个体间高度多态基因组特定区域的基因型，通过评估阵列上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， SNP)等位基因模式，进而识别aCGH不能检测到的三倍体。此外，SNP还可以额外检测单亲二倍体(ulrich's periodicals directory, UPD)、嵌合体、合子、母系细胞污染和亲缘关系[12]。目前SNP技术已广泛应用于先天性异常、认知缺陷、发育延迟、生长异常或行为异常的临床评估[13]。

2 CMA在产前诊断中的应用

2.1CMA在超声检查为异常胎儿中的诊断 随着社会的发展，人们认识到胎儿结构异常与基因组失衡之间存在着密切的关联性，特别是与唐氏综合征、爱德华综合征和帕托综合征相关的结构异常。与核型分析相比，产前检查发现胎儿超声结构异常时，CMA诊断常见非整倍体染色体异常的准确率可达100%[14]。有研究指出，与CMA异常最密切相关的器官及系统主要包括心脏、肾脏、骨骼、泌尿生殖系统和中枢神经系统。国外研究表明，66.7%的心脏缺损患者为CNVs，而非22q11.2缺失[15-17]。此外，超声检查结果提示胎儿心脏结构异常时，常使用FISH检测其是否存在22q11.2缺失，往往忽略了超过2/3的基因组异常。因此，对于特定的心脏结构异常，FISH检测的诊断率可能会大大降低[16]。有数据表明，CMA对心脏结构异常和肾脏分离的诊断率较核型分析相比分别增加了10.6%和15.0%，诊断率位于胎儿单器官畸形诊断第一位[17]。最新一项研究证实,CMA对最常见的先天性心脏缺损(如室间隔缺损)的CMA致病性CNV检出率明显高于核型分析，且对孤立的心流出道异常检出率(36.1%)显著高于非孤立型(1.3%)[18]。Sun等[19]采用SNP arrays分析技术检测到胎儿在4q35.2处出现0.72 Mb重复，与癫痫和心脏异常有关，同时在PARK 2基因的6q26处发现了0.13 Mb的缺失，且与常染色体隐性遗传病(如青少年帕金森病)有关。国外研究表明，由UPD导致的部分肾脏疾病(如贝克德-威德曼综合征和罗素-银综合征)可以表现为特殊的超声结构异常，此种情况只能由SNP arrays分析技术加以证实[20-21]。Borrell等[22]对CMA和核型分析在胎儿生长受限中的诊断率进行了系统回顾和meta分析，数据显示，在非畸形和畸形的胎儿生长受限中，CMA较核型分析诊断率分别增加了4%和10%，最常见的致病性CNV为22q11.2型。

此外，涉及临床显著基因组区域的微缺失和微复制也与特定的遗传综合征有关，如77%的DiGeorge综合征患儿是由于22号染色体近端长臂区的亚显微缺失[23]、Miller Dieker综合征为17号染色体短臂末端微缺失导致大脑皮层发育不足或发育不良、包含HNF1B基因的17q12微缺失与肾囊肿和糖尿病综合征有关[20-21]。Srebniak等[24]通过SNP arrays分析技术对1033例超声异常的胎儿进行研究，结果表明，约5.5%的患儿具有致病性CNV，其中58%与病因有关，35%为神经发育障碍相关疾病，6%为意外发现的早发型疾病，建议孕妇将SNP arrays分析技术作为胎儿超声检查异常的第一层测试。

2.2CMA在核型分析及超声检查为正常胎儿中的诊断 在超声检查和核型分析正常的孕妇中，CMA能够检测出额外的非整倍染色体发生风险，如亚显微畸变导致的早发性疾病、携带神经发育障碍易感位点及晚发性疾病[25]。Srebniak等[24]回顾10 614例核型分析正常的父母亲的临床资料，采用meta分析评估CMA技术，结果发现，0.84%的高龄产妇(advanced maternal age, AMA)和有焦虑情绪的父母亲出现了具有临床意义的致病性CNV，且36岁以下的产妇患有致病性CNV的风险高于唐氏综合征的发生风险(1∶180)。Li等[26]对72例NT>5 mm的孕妇进行研究，并在核型分析正常的情况下进行CMA，结果显示，染色体缺陷胎儿12例，其中致病性CNVs 5例。目前NT测量在我国早已普及，当NT异常时，孕妇会选择无创DNA或核型分析，CMA虽然能够识别超声检查和核型分析未能检测出的染色体异常，但在AMA或早孕筛查异常的孕妇中暂未普及，其中最主要的原因是部分CNVs(如16p11.2微缺失)临床暂时难以确定其基因型-表型相关性，但是伴随时间的推移、遗传学相关知识的不断更新、共享数据库内容的扩充及与疾病有明确关联性的基因组数量不断地增加，终将使VOUS的发生率不断降低，如最初美国儿童健康与人类生长发育研究所发现的致病性CNV和VOUS的发病率分别为0.9%和2.5%，而根据最新的研究结果及全球数据知识共享，发现致病性CNV的发病率增加到1.8%，VOUS的发生率减少到0.9%[27]。

2.3CMA在流产组织中的应用 妊娠丢失是一个常见的生殖问题，临床15%～20%的妊娠以自然流产告终，并且约1%的女性经历过多次流产[28]。Zachariah等[29]研究报道，流产病因分析对女性未来的生育计划和未来妊娠的产前护理有重大影响。当第一次妊娠以流产告终，再次妊娠的围产期不良结局(如胎膜早破、早产、胎儿生长受限、子痫前期和剖宫产)的发生风险会增加。有学者发现孕20周之前发生自然流产的女性中约50%是由染色体异常引起，主要表现为染色体数目及结构异常，其中结构畸变和嵌合体发生率则较低[17]。22q11.21和1p36.33缺失为最常见的致病性CNV[30]。传统的核型分析需要先对新鲜的流产组织细胞进行培养，因培养周期长、失败率高和母体细胞易污染等问题导致假阴性率较高。CMA具有较高的自动化程序和诊断率，并且对标本的要求较低(无需新鲜的流产组织)，一方面可检测非整倍染色体和更大的结构变化，另一方面还能发现嵌合体及流产组织中微妙的染色体失衡，在流产组织分析中具有广阔的应用前景。Sahoo等[31]对8118例流产组织进行了CMA，结果显示，CMA对新鲜标本的诊断率达94.2%，对非新鲜标本的诊断率达86.4%，可最大限度地提高敏感度，减少假阴性。有研究显示，CMA对早期自然流产组织的诊断率明显高于常规核型分析，并且CMA还能检测出与临床相关的遗传信息[30]。

2.4CMA在着床前遗传诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)和植入前基因筛查(preimplantation genetic screening, PGS)中的应用 目前PGD主要用于单基因遗传疾病携带者(显性和隐性、常染色体或X连锁)和结构染色体异常携带者的诊断；PGS主要用于辅助生殖治疗，通过移植整倍体胚胎来提高妊娠成功率。在PGS应用过程中，由于CMA不存在组织培养失败、人为因素等问题，加之周转时间较快，已逐渐取代FISH[32]。PGS联合CMA除了能识别一般的染色体异常，还能识别复杂染色体重排。Frumkin等[33]对1例核型分析证实胎儿染色体正常的父母亲进行分析，经CMA检测发现父亲染色体出现46，XY，t(3；7；9)(q23；q22；q22)复杂易位，提示临床可通过PGD联合CMA选择性移植1个染色体正常的胚胎，进而得到1个健康的婴儿。

与FISH和aCGH相比，SNP arrays分析技术可以同时生成与整个染色体相关的定性(基因型)和定量(基因拷贝数)数据，并且已经应用于植入前胚胎胚卵裂球和囊胚滋养外胚层细胞的遗传学分析，主要用于检测46条染色体的非整倍体。Yao等[34]通过SNP arrays分析技术发现从不正常受精卵或质量不佳的受精卵中提取的人类胚胎可以发育为囊胚，为将来胚胎的研究和临床应用提供了理论依据。

3 CMA的优势与局限性

与传统细胞学诊断相比，CMA的优势如下：①可以分析更广泛地组织类型，不需要进行组织培养，可对从未培养的绒毛、羊水、胎儿组织和血液中提取的DNA进行CMA，包括保存的标本和石蜡切片[32]；②可以检测到分辨率为0.05～0.1 Mb的亚显微缺失和重复，而核型分析常识别分辨率为3～10 Mb的染色体改变[35]；③可以根据研究目的定制特异性平台；④属于客观评价而非主观评价；⑤数据结果与基因组数据库相兼容；⑥易于自动化，从而使周转时间更快，降低故障率，具有更高的成本效益分析[33]。

与其他技术一样，CMA也存在局限性：①不能识别平衡易位(倒数和罗伯逊)和倒置；②不能检测小于10%低水平的嵌合体[35]；③可能漏掉四倍体和(或)三倍体；④易遗漏在平台覆盖范围之外的CNV；⑤不能发现点突变、基因表达和甲基化异常；⑥负阵列并不能100%排除由个体突变和其他基因组原因所造成的疾病[32]；⑦若发现VOUS，在遗传咨询过程中可能会引起临床医师的困惑和父母亲焦虑。然而，相信在不久的将来，由于共享临床数据库收集的相关信息，将会使得先前不确定的发现被重新归类为良性或致病性范畴，VOUS的发生率亦会不断降低。

4 产前咨询与结果解读

产前咨询是为了让患者更好地了解各种检测方法的优点及其局限性，从而根据自身需求做出选择。在绒毛膜采取、羊膜穿刺术后或PGS联合绒毛膜采取时，均建议由遗传学顾问、遗传学专家或在遗传咨询方面具有专业知识的医疗保健提供者给予咨询[36]。最新指南将CNVs解释为致病、可能致病、不确定、可能是良性[37]。CNVs的医学相关性与基因微缺失、基因复制功能有关，当失衡区域发生于关键基因或重要的调控区域时，可能产生表型效应。对于某些罕见的染色体畸变(14Q部分三体)或不确定意义的CNVs，因其需要对大量病例进行全面分析，故难以建立基因型-表型相关性，从而给临床医师向患者提供适当咨询方面增加了负担[38]。此外，最新指南建议对于CMA结果的解读可以借鉴文献和公开数据库中的结果，包括基因组变异数据库、解密数据库、国际细胞基因组阵列标准和人类孟德尔遗传数据库等。

5 展望

与常规细胞学诊断相比，CMA在分辨率、成本效益、自动化程序等方面展现了其独特的优势，也逐渐应用于临床各个领域。虽然在临床应用时可能会存在VOUS,但随着技术的不断提高、CMA平台的日渐成熟及更多大规模前瞻性队列研究，CNV数据库终将不断完善，更多染色体疾病的基因型-表型关系将会阐明，逐渐解决临床医师所面临的困难，相信CMA在未来产前诊断领域将展现更大的应用价值。