基于幼苗光合及叶绿素荧光参数的3种咖啡耐低温胁迫的综合评判

黄丽芳 李金芹 王晓阳 董云萍 龙宇宙 段志强 陈婷 闫林

摘要：【目的】探索低温逆境胁迫对咖啡幼苗光合及叶绿素荧光参数的影响，为咖啡抗寒育种、引种栽培提供科学依据。【方法】以3种咖啡幼苗为材料在8℃下分别持续0、24、48、72h低温胁迫试验，观察叶片的叶绿素含量、气体交换参数及叶绿素荧光参数等指标的影响，利用隶属函数对咖啡的抗寒性进行综合评价。【结果】（1）大粒种和小粒种咖啡幼苗随着低温胁迫时间的延长，叶绿素含量先上升后下降，中粒种咖啡幼苗总体是下降趋势。（2）3种咖啡幼苗的净光合速率下降是由非气孔因素导致的，净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、水分利用效率和气孔限制值等光合参数在3种咖啡幼苗低温处理间差异不显著，处理和对照间差异显著。（3）在叶绿素荧光参数方面，3种咖啡幼苗的初始荧光总体水平上均有所上升，表明其Psn中心遭到低温胁迫的损伤程度较严重。非光化学猝灭系数呈先上升后下降趋势，Psn最大光化学效率、光化学猝灭系数、表观量子传递速率和实际光化学量子产量均下降，大粒种咖啡幼苗的下降幅度较中粒种和小粒种咖啡幼苗大，表明其叶片受低温胁迫损伤程度大。采用隶属函数法综合评判3种咖啡的抗寒能力，小粒种咖啡幼苗的平均隶属度最高，表明其抗寒能力较强，中粒种和大粒种咖啡幼苗的抗寒性则较弱。【结论】综合不同的光合及荧光指标，运用隶属函数法能较全面地评判咖啡幼苗的抗寒性，避免了单一指标评判的片面性，其鉴定结果准确可靠。

关键词：咖啡;低温胁迫;光合作用;叶绿素荧光参数;抗寒能力

中图分类号：S 571.2

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（ 2020） 10-1063-08

0 引言

【研究意义】咖啡属植物约有100多种，通常所指的咖啡分为阿拉比卡咖啡（C arabica Linne）（俗称小粒种咖啡）、甘弗拉咖啡（C.canephora Pierre）（俗称中粒种咖啡）、利比利卡咖啡（C.libericaBull ex Hiem）（俗称大粒种咖啡）[1-3]。中国咖啡主产区为海南、云南，但冬季常有低温危害，通常限制了咖啡的开花、坐果、引起咖啡颗粒过小、不饱满、缺陷豆比例上升，影响咖啡的产量和品质[4]，严重的可导致植株的死亡，给咖啡生产带来巨大损失，制约了我国咖啡产业发展。2013-2014年采收季，咖啡种植面积最大的普洱市受灾2.43万hm2，经济损失巨大。低温胁迫下作物光合能力的强弱可从光合指标和叶绿素荧光参数等多方面反映[5]。光合作用是植物合成有机物和获取能源的根本途径，关系着植物的生长状况、品质优劣[6-7]。叶绿素荧光参数的变化可在一定程度上反映环境因子的变化及其对植物光合生理产生的影响，已被广泛应用于植物光合机理和逆境生理等研究领域。【前人研究进展】在咖啡逆境生理方面，卫新中等[8]通过外源ABA处理低温胁迫下（4～5℃）整株和离体的小粒种咖啡叶片，表明了ABA与咖啡抗冷性密切相关。高敏等[9]研究了低溫霜冻天气对咖啡杯品的影响，结果显示霜冻前咖啡杯品平均得分高于霜冻后，寒害程度越重，咖啡杯品得分越低，品质下降越多。郭玉华等[10]从光合特性方面探讨了夜间低温对小粒种咖啡和大粒种咖啡的影响，阐明了小粒种咖啡相对比较耐寒。这与其较强的非辐射耗散能力、较大的胡萝卜素/叶绿素及较强的恢复能力有关。Ramalho等[11-12]研究了冷胁迫条件下不同基因型咖啡的矿物质含量动态变化，以及不同冷胁迫时期咖啡植株的氧化应激反应等。Fortunato等[13]以小粒种和中粒种以及2份杂交种的咖啡苗为材料，研究了在冷条件下抗氧化系统的生物化学及分子特性，结果表明，中小粒种杂交种的冷驯化能力最强，小粒种次之。目前，对植物的抗寒性进行综合评价常采用隶属函数法，已在乌菜[14]、梨[15]、怪柳[16]以及彩叶藤本植物[17]上进行了研究。【本研究切人点】关于主栽的3种咖啡的抗寒性鉴定，低温胁迫对咖啡幼苗光合及荧光特性的综合评判鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究采用人工低温胁迫方法对3种咖啡材料进行处理，测定光合及叶绿素荧光参数的变化，采用隶属函数法综合评价其抗寒性，筛选抗寒性强的咖啡种质材料，以期探明低温胁迫下咖啡的光合特性，为咖啡抗寒选育种、引种栽培提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来自中国热带农业科学院香料饮料研究所，小粒种咖啡为云南省主栽品种卡蒂姆CIFC7963，中粒种咖啡为海南省主栽品种热研4号，大粒种咖啡为大韩。培养到苗龄10～11月，选取健康状况良好、长势一致的植株转移至人工气候箱中进行低温处理。每种咖啡为1个处理，每个处理3株，重复3次。

1.2 试验方法

试验设置8℃低温胁迫，以Oh为对照（CK），光照强度为200 μmol.m^-2.s^-1，时间设置为12 h/12 h，相对湿度保持70%左右。分别在低温胁迫0、24、48、72 h时进行光合和叶绿素荧光指标的测定。

叶绿素含量（ Chl）测定：应用SPAD仪进行测定，测定时选择咖啡完全展开的功能叶片的中部，于主脉两侧共读取6个读数，每个处理重复测定5个叶片，并计算平均值。

采用便捷式光合系统分析仪LI-6400（ LI-COR，USA）测定各咖啡幼苗的第三或第四片完全展开叶片的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、胞间CO2浓度（ Ci）和气孔导度（Gs）等指标，并计算水分利用效率（ WUE）和气孔限制值（Ls），WUE=Pn/Tr，Ls=1-Ci/Ca。测定条件：温度为测定时幼苗所处温度，光强度1 000 μmol.m^-2s^-1，流速为500 μmol.s^-1，CO2气体由小钢瓶提供，控制浓度为400 μmol.mol^-1，每个处理分别测定3次。

叶绿素荧光参数：采用荧光叶室6400-40测定不同梯度处理的咖啡幼苗叶绿素荧光参数。测定光化光强度为188 μmol.m^-2s^-1，强饱和脉冲光强度为2 400 μmol.m^-2s^-1，脉冲光时间为0.8 s。测定前先将叶片暗适应20～30 min，后测定初始荧光（Fo）、PSII最大光化学效率（FJFm）;光适应下PSII实际光化学量子产量（φPSII）、非光化学猝灭系数（qN）、光化学猝灭系数（ qP）和电子传递速率（ETR），每个处理分别测定3次。

咖啡耐寒性综合评价参考刘杜玲等[18]的方法，抗寒系数=（低温胁迫后72 h指标测定值/对照指标测定值）×100%。

采用模糊综合评判方法中的隶属度公式，综合评价不同咖啡的耐寒性。参照陈明辉等[19]的方法，计算隶属函数值和平均隶属度。与耐寒性呈正相关的指标用公式（1）计算，与耐寒性呈负相关指标的用反隶属函数公式（2）计算：

在所有参试材料中的最小值和最大值。隶属函数平均值越大，则耐寒性越强。

1.3数据统计与分析

所有数据均为3次重复的均值，采用Excel 2007和SPSS25.0软件进行数据处理，采用LSD检验（a=0.05）进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1低温胁迫对咖啡叶片叶绿素含量和光合参数的影响

由表1可知，大粒种和小粒种咖啡随着低温胁迫时间的延长，叶绿素（ Chl）含量呈现先上升后下降的趋势;大粒种和中粒种咖啡Chl含量在各处理间的差异不显著（P>0.05），小粒种咖啡各处理间差异达显著冰平（P<0.05），48h比CK上升了28.72%。不同咖啡品种在8℃低温胁迫过程中Chl含量的变化程度不同。

3个品种在低温胁迫过程中，处理组的光合速率（ Pn）与CK的差异达到显著水平，大粒种和中粒种咖啡处理间差异不显著，小粒种咖啡处理72 h时与CK和24 h处理差异达显著水平（P<0.05），比CK下降了97.54%;3种咖啡的Tr、WUE、Ls和Gs几乎都呈现下降趋势，大粒种咖啡的Tr和WUE各处理间差异不显著（P>0.05），中粒种和小粒种咖啡的Tr含量和WUE含量均在72 h时相对显著于CK处理，小粒种咖啡的Tr和WUE降幅最大，比CK下降了82.33%和86.60%;3种咖啡的Ls在低温胁迫3个处理间的差异均不显著，只有中粒种咖啡的CK与各处理达到显著差异水平（P<0.05）;大粒种咖啡的Gs含量72 h时降到最小值，与CK相比，下降了80%。3种咖啡的胞间C02浓度（Ci）均呈上升的趋势，低温处理72 h与CK差异达显著水平（P<0.05）。

2.2 低温胁迫对咖啡叶片叶绿素荧光参数的影响

由表2可知，在低温胁迫过程中，大粒、中粒和小粒种咖啡的初始荧光（Fo）含量呈先上升后下降的趋势，在48 h时达到最大值，分别比对照上升了19.59%、17.03%和8.26%，且Fo均未达到显著状态（P<0.05）。各供试材料在低温胁迫后的FJFm、光化学猝灭系数（qP）、表观量子传递速率（ETR）和PSII实际光化学量子产量（φPSII）均下降，且随胁迫时间的延长，下降幅度均增大，大粒种4个指标的降幅都为最大值，达到31.08%、88.68%、85.77%和88.24%。3种咖啡低温处理24、48、72 h的qP、ETR和φPSII与CK差异达到显著水平（P<0.05），小粒种咖啡的Fv/Fm在低温胁迫72 h时与前面3个处理的差异迭到显著水平。大粒种和小粒种咖啡的非光化学猝灭系数（qN）表现为先升高后降低的趋势，小粒种咖啡处理24 h和48 h与CK相比达到显著水平（P<0.05），72h与CK差异不显著。

2.3不同种咖啡各单项指标的抗寒系数

由表3各单项指标的抗寒系数可看出，不同咖啡幼苗抗寒系数值所反映的抗寒性不同。3种咖啡幼苗经过8℃低温胁迫72 h时，与CK组相比，各指标在低温胁迫后均有不同程度的变化，大粒种咖啡的Chl、Pn和Ls抗寒系数为最大值，中粒种咖啡的Tr、Ci、WUE、 Gs、 qP、qN、 ETR、Fo、Fv/Fm和φPSII抗寒系数为最大值，小粒种咖啡的Pn、Tr、Ci、WUE、Gs和Fo抗寒系数为最小值，说明同一种质各指标的抗寒系数存在较大差异，同一指标在不同种质间也存在明显差异，反映出不同种质对低温胁迫的敏感程度不相同。

2.4 各抗寒指标间的相关性分析

表4的相关分析表明，Chl含量与qP、qN、φPSII呈极显著正相关（P<0.01），与FJFm呈显著正相关（P<0.05）;Pn与Tr、WUE、Ls、Gs、qP、ETR、Fv/Fm呈极显著正相关（P<0.01）;T与Gs、qP、ETR、Fv/Fm呈极显著正相关（P< 0.01）;Ci与Pn、WUE、Ls、qP、ETR、FJFm呈极显著负相关（P<0.01）;WUE与Ls、qP、ETR、Fv/Fm，Ls与qP、ETR、FJFm呈极显著正相关（P

2.5 不同种咖啡单项指标主成分分析

主成分分析结果表明（表5），各因子特征值中，前3个因子的贡献率分别为48.23%、20.37%和16.23%，累积贡献率达84.83%。因此，抽取前3个因子，可将原来各单项指标转换成3个综合指标（分别用Al、A2、A3表示）。Al在Pn、qP、ETR和Fv/Fm上有较高载荷量，A2在Chl、qN和φPSII上有较高载荷量，A3在Ci和Gs上有较高载荷量。

2.6 不同种咖啡抗寒性的综合评判

由单一指标评价植物的抗寒性具有片面性，因此，用多个指标综合评价咖啡的抗寒性才较为可靠。不同种咖啡抗寒性综合评判结果表明：Ci与其他指标呈负相关，起负面作用，其值越高，抗寒性越低，利用反隸属函数，而其他指标对咖啡抗寒起正向作用，采用隶属函数法，咖啡品种抗寒性平均隶属函数综合评价表现为小粒种>中粒种>大粒种。小粒种咖啡的平均隶属函数值最高，为0.16，耐寒性最强，中粒种和大粒种咖啡的平均隶属度差异不大，耐寒性较弱，分别是0.11和0.10（表6）。

3 讨论与结论

3.1 低温胁迫与叶片相对叶绿素含量

叶绿素含量的多少与植物叶片光合作用能力强弱有直接关系，叶绿素含量越高，代表植物捕获光能的能力越强。叶绿素捕获光能的能力还受温度的影响[20]，温度影响植物体代谢进程，从而影响合成Chl的原料供给，造成Chl含量升高或者降低[21]。本研究低温胁迫期间中粒种咖啡叶片的Chl含量总体是下降趋势，低温导致叶绿素合成过程受到阻碍如光合酶的活性受到抑制，或是叶绿体超微结构被破坏，使植物叶片内Chl含量降低[22-23]。而大粒种和小粒种叶片的Chl含量呈现先上升后下降，可能是由于在适当的低温环境下咖啡通过自身调节适应温度的变化，诱导咖啡光合色素含量升高，但当低温时间延长，超出其承受范围，导致光合色素分解，叶绿素含量降低，这与大叶冬青[24]、草地早熟禾[25]、紫色小白菜[7]对低温的响应一致。

3.2 咖啡幼苗抗寒性与光合参数

低温直接影响植物光合器官结构和能量生成、利用能力，间接影响光合作用，光合作用的强弱通过光合参数反映[5，26]。小粒种咖啡幼苗在正常处理以及低温胁迫48 h时Pn均最大，说明小粒种咖啡幼苗的光合能力较强。本研究随着低温胁迫时间的延长，3种咖啡幼苗的Pn、Tr和Gs呈不同程度的下降趋势，而Ci升高，表明Pn下降是因为叶绿素、光化学活性、无机磷和RuBP羧化的限制，导致细胞间隙CO，积累，由非气孔因素导致的[27-28]。Tr、Gs、WUE和Ls都大幅下降，表明低温胁迫下植物叶片气孔开张度变小，导致植株WUE和Ls也随之减少，从而减小了蒸腾拉力。Pn、Tr、WUE、Gs和Ls等光合参数大多在3种低温处理间差异不显著，处理和对照间差异显著，也许是由于咖啡是热带作物，突然遭到低温胁迫，光合系统受损，各光合参数显著降低，而随着胁迫时间的延长，植株逐渐适应低温环境，光合参数值下降趋势变缓。

3.3 咖啡幼苗抗寒性与叶绿素荧光参数

叶绿素荧光分析技术在植物应答逆境胁迫过程中被广泛用于抗性种质的评价和抗性机理研究，有助于探明光合机构受逆境胁迫伤害的部位和程度[29]。Fo是PSn反应中心完全开放状态时的荧光强度[19]，低温条件下，PSII反应中心遭受类囊体膜损伤或者不易逆转的破坏等，都会导致Fo上升，受损程度与Fo增加量成正比[30]。本研究中，3种咖啡幼苗的F。总体水平上均有所上升，小粒种咖啡幼苗的幅度较小，大粒种咖啡和中粒种咖啡幼苗的上升幅度较大，表明其PSII中心遭到低温胁迫的损伤程度较严重。qN反映了光系统Ⅱ反应中心非辐射能量耗散能力的大小，3种咖啡幼苗在低温胁迫24 h时qN均呈现上升趋势，暗示植物已通过启动光保护反应来避免过量光伤害，随低温胁迫时间的延长，qN含量又有所降低，PSII反应中心开放度减小，光合电子传递活性减弱，与陈梅[31]、周福平[32]的试验结果一致。FJFm是植物抗寒性的主要指标，在多种植物研究中发现抗寒力弱的品种（系）比抗寒力强的下降更快速[33]。φPSII、qP和ETR显著下降说明低温减弱QA的氧化能力及Psn的电子传递能力，导致碳同化降低，光合系统受损[6]。大粒种咖啡幼苗的Fv/Fm、qP、ETR和φPSn下降幅度都最大，表明其叶片受低温胁迫损伤程度越大，国内学者对不结球白菜和甜瓜的研究表明，耐寒性弱的品种（系）光化学效率和有效性电子传递能力比不耐寒的要低，光合受抑程度较重，本研究结果也证实了这一点[34-35]。

综上所述，8℃低温胁迫可严重抑制咖啡幼苗的光合作用和生长，PSII反应中心受到损伤，前期咖啡幼苗可以通过启动光保护反应及减小叶片气孔开张度及蒸腾拉力来避免过量的光伤害，但随着胁迫时间的延长，光合电子传递活性减弱，损伤程度加剧。采用主成分分析法和隶属函数法对各抗寒性不同的光合及荧光指标进行综合分析发现，3种咖啡幼苗的抗寒能力由强到弱依次为：小粒种咖啡>中粒种咖啡>大粒种咖啡，中粒种和大粒种咖啡幼苗耐寒性差异并不大，这和生产实践中的结果较一致。在今后的工作中，还应从与耐寒性相关的特异基因与蛋白质表达等方面开展更深入的研究，从实际生产和理论基础两个层面系统解释与完善咖啡的抗寒机理。

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作者简介：黄丽芳（1985-），女，硕士，助理研究员，研究方向：咖啡遗传育种（E-mail： hlf032@163.com）

通信作者：闫林（1980-），女，博士，研究员，研究方向：咖啡种质资源与遗传育种（E-mail： yanlin2575@163.com）