香蕉MaAQP1启动子诱饵载体及干旱胁迫酵母单杂交cDNA文库的构建

许奕 李羽佳 魏卿 王安邦 王笑一 宋顺 李敬阳

摘要：【目的】香蕉MaAQP1能够提高植物的耐旱性，研究香蕉MaAQP1的相关特性可为了解其干旱胁迫响应机制奠定基础。 【方法】通过克隆MaAQP1的启动子，将启动子构建到pHIS2诱饵质粒上，转化酵母菌构建诱饵表达载体，同时构建干旱胁迫的香蕉（Musa acuminat L.AAA group cv. Brazilian）cDNA文库。 【结果】克隆获得1362 bp的启动子序列，通过分析其顺式作用元件，结果显示启动子序列中共有72个顺式作用元件，包括了TATA-box和CAAT-box核心元件，ABA响应元件、MYB元件、MYC元件、ERE元件、MejA响应元件、光响应元件以及分生组织响应元件等;成功构建了MaAQPI诱饵载体和干旱胁迫条件下的cDNA文库，文库库容为1.25×107 CFU，插入片段平均在1200 bp左右。 【结论】本研究克隆获得了香蕉MaAQPI启动子并构建了干旱胁迫酵母单杂交cDNA文库，为下一步运用酵母单杂交筛选MaAQPI互作的转录因子、解析MaAQPI响应干旱胁迫的作用机制奠定了基础。

关键词：香蕉;干旱;MaAQP1;诱饵载体;cDNA文库

中图分类号：S 668.1

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（ 2020） 10-1078-08

0 引言

【研究意义】香蕉（Musa acuminat，AAA groupcv.Brazilian）是热带地区的重要经济作物之一，被联合国粮农组织（FAO）定位为发展中国家仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。然而其根系浅生，易受旱，干旱胁迫极大地伤害香蕉正常的生理代谢活动，造成香蕉减产和品质下降，是香蕉产业中亟需解决的关键问题。【前人研究进展】香蕉水通道蛋白（ Aquaporin，AQP）是生物体内广泛存在的一类位于各种细胞膜上24～34 kD的小分子跨膜蛋白[1-2]，隶属于MIP（ Major intrinsic protein，MIP）超家族，能够调节水分以及甘油、硼、二氧化碳等小分子物质的运输[3_4]。AQP在植物的生长发育中起着重要的作用[5-7]，如种子萌发、细胞伸长、种子发芽、生殖生长和气孔运动等[8]。越来越多的研究表明，AQP能够维持植物中水的稳态响应各种非生物胁迫[4]，主要包括冷害、盐害、旱害等。近年来的研究结果表明AQP能够提高植物的抗旱性，在植物中过表达OsPIP1、OsPIP2、VfPIP1、BnPIP1能够增加植物对渗透胁迫或干旱胁迫的耐受性‘卅。过表达TaAQP7提高了转基因烟草的抗旱性[9]。用小麦TaTIP2; 2转化拟南芥提高了转基因植物的抗旱能力[10]。【本研究切人点】前期试验表明了MaAQP1提高了转基因拟南芥的抗旱性[11]，而其提高植物抗旱性的作用机制仍未有报道。【拟解决的关键问题】本试验通过对干旱胁迫的香蕉进行cDNA合成及文库构建，克隆MaAQP1启动子并构建其诱饵载体，为进一步进行酵母单杂等研究MaAQP1响应干旱胁迫的作用机制奠定了基礎。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1植物材料 将5叶1心的巴西蕉（Musa acuminat L.AAA group cv.Brazilian）进行干旱胁迫处理[11]，当土壤含水量为45%时取根、茎、叶一起混合冻样。

1.1.2试验试剂 Plasmid Maxi Kit购自德国Qiagen公司，TRIzoIReagent购自美国Invitrogen公司，lkbDNALadder和超纯琼脂糖购自上海海科生物技术有限公司，Taq DNA聚合酶等购自宝生物工程有限公司。cDNA文库构建试剂盒购自Clontech公司;Adenine Sulfate（ Ade）为Amresco公司产品。各种工具酶、Marker购自TaKaRa公司。PCR引物合成和测序由华大完成。

1.2试验方法

1.2.1 MaAQP1启动子克隆及序列分析 在香蕉全基因组测序[12]的基础上通过香蕉A基因组网址（http：//banana.genome.cirad.fr/）获得 MaAQP1的ATG起始密码子的2 kb的5'侧翼区域。通过引物从香蕉基因组DNA扩增序列，最后获得MaAQP1的翻译起始位点（ATG）的1 362 bp视为全长启动子，将其构建到pMD19.T载体上并测序确认。利用启动子顺式作用元件预测软件PlantCARE（http：//bioinfomatics.psb.ugent.be/Webt001s/plantcare/thml/）对该启动子元件进行预测分析。

1.2.2 pHIS2一pMaAQP1诱饵载体构建 根据MaAQP1启动子序列分别在其两端添加Eco RI和Sac I的酶切位点序列设计引物，引物序列pMaAQP1.FAAGAATTCCTGCGACGGTTCGTAAAGAG;pMaAQP 1-R：GGGAGCTCTGAGTGGAGGAATCAGGGTG，从pMD 1 9T—pMaAQP1上进行扩增，将扩增条带回收，和pHIS2表达载体分别用Eco RI和SacI进行双酶切，酶切产物分别纯化回收后进行连接，连接产物转化到E.c01iDH5a感受态细胞中，活化后涂布于LB固体培养基上（内含30 ng.mL^-1Amp），37℃过夜培养后挑取单菌落摇菌，提取质粒进行酶切鉴定，然后选取阳性单克隆送华大基因测序，测序正确的即为诱饵载体pHIS2一pMaAQP 1。

1.2.3诱饵载体转化酵母菌株及自激活检测 将诱饵质粒pHIS2.pMaAQP1、阳性和阴性对照分别转化到酵母菌Y187感受态中，并涂布于平板SD—TIp—Leu—His+50 mm01.L^-13AT上生长。从SD—T平板中挑取单菌落于50 mL液体培养基中，在温度30℃、转速225 r.min^-1培养18 h。将菌液转接于500 mL液体YPDA培养基中，使初始0D600=0.2，30℃，转速824 r.min^-1条件下培养4～5 h，至0D600=0.6。在转速1 737 r.min^-1下离心5 min集菌。依次用30 mL无菌H2O，转速1 000 r.min^-1，室温下5min集菌并弃上清。依次用20mL0.1 mol.L 1LiAc，10mL 0.1 mol.L^-1LiAc重复上一步骤，离心集菌弃上清。向离心管中依次加入1.44 mL lmol.L^-1LiAc.9.6 mL 50%PEG3350，25μg文库质粒DNA，300μLssDNA（10 mg.mL^-1）剧烈振荡1 min至完全混匀。在30℃水浴中孵育30min。42℃水浴热激25min。重复30℃水浴1h。在室温下转速1 453 r.min^-1离心5 min离心集菌弃上清。每个转化用200μL无菌H20重悬菌体，温和混匀，并涂布于相应的缺陷型平板中，在30℃中培养3～4 d。

分别从表1中各转化的平板上各随机挑取3个单菌落，稀释后涂板至对应的不添加histidine、添加不同浓度（25、50 mmol.L^-1）3AT的缺陷型平板上（3AT是酵母HIS3蛋白合成的竞争性抑制剂，用于抑制His3基因的泄漏表达），30 ℃恒温培养3d。记录每块平板上的克隆数，并计算每个转化反应在缺陷平板上的转化子数量和生長率。

1.2.4用于构建文库的cDNA合成 用CTAB法提取干旱胁迫处理的香蕉组织，使用Oligotex mRNAKits（ Qiagen）分离纯化样本的mRNA。用Supscriptdouble stand cDNA Kit分别进行cDNA第一链和第二链的合成，加5接头（3个读码框，每个读码框连接一份，共3份），使用1%浓度的低熔点琼脂糖胶，电泳cDNA产物，切胶同收1 000 bp以上的片段，用14 μL的DEPC水溶解回收产物。1%琼脂糖凝胶电泳检测.

1.2.5 酵母单杂交文库构建

（1） cDNA与载体的连接使用同源重组的方式，将7 μL cDNA与3μL的经酶切处理线性化的pGADT7-Rec2（单杂交）载体，5μL的Infusion重组酶和5μL的H2O混匀。于50℃反应1h，加入2 μL灭活的Proteinase K重组酶，78 μL无菌H2O至总体积为100 μL，加入1μ1 Glycogen（20μg.μL^-1），375 μL100% ethanol，50 μL 7.5 mol.L^-1NH40Ac，混匀并于80℃th，在4℃下，转速6 948 r.min 1离心30 min-弃上清，加入150 μL 70%乙醇，在4℃下，转速6 948r.min^-1离心3 min，重复此步骤一次，去尽上清，在室温下将cDNA晾干5～1 min。用10 μL DEPC H20重悬cDNA，瞬离2s收集cDNA，置冰上。

（2）电转化大肠杆菌感受态细胞 每2.5 μL的重组产物转化50 μL感受态细胞，将1 mm电转杯（ Bio-Rad）置于80℃预冷30 min。将2.5 μL重组产物和50 μL感受态细胞加入电转杯，置冰上45 mm。于电转化仪（ Bio-Rad）上电击，电击后迅速向电转杯中加入LB培养基1 mL，然后取人到新的15 mL离心管，补足体积到5 mL，置于37℃，824 r.min_1～868 r.min^-1离心培养至少t h。培养结束后，将培养物依次稀释10、100、1 000、10 000倍，分别取10μL稀释液涂平板，剩余培养物可4℃保存过夜，或者加入甘油至终浓度20%存于-80℃。

（3）构建文库质量鉴定库容量的鉴定：取转化后菌原液10 μL稀释1 000倍后，从中取出 10μL涂布LB平板（含氨苄抗性）.第2d计数。库容量（ CFU.mL^-1）=平板上的克隆数/10×1000×10³，文库总库容量（CFU）=库容量×文库菌液总体积。插入片段大小鉴定：挑取平板上的单克隆，PCR扩增，电泳检测PCR产物大小。

2 结果与分析

2.1基因启动子的克隆

如图1所示，根据香蕉A基因组网站（http：//banana-genome.cirad.fr）设计启动子的引物进行扩增，扩增长度为1 362 bp。

2.2 基因启动子的序列分析

通过plantcare和PLACE（ www.dna.affrc.go.jp）分析其顺式作用元件，结果显示了1 362 bp的启动子序列中共有72个顺式作用元件，包括了TATA-box和CAAT-box核心元件，ABA响应元件ABRE、MYB元件、MYC元件、ERE元件、MejA响应元件，BOX II、G-box、GTl-motif、I-BOX等光响应元件，以及分生组织响应元件等（表2）。

2.3诱饵载体的构建

取转化了诱饵载体的大肠杆菌菌液进行PCR扩增，将产物用l%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。并对扩增得到阳性条带的克隆质粒抽提和测序。测序结果正确，同时其菌落PCR结果如图2，条带正确，说明MaAQP1启动子片段连接到了表达载体pHIS2上。

2.4 诱饵载体转化酵母菌株及自激活检测分别从3个不同转化反应的平板上各随机挑取3个单菌落，稀释后涂板至相应的不添加Histidine（组氨酸），添加不同浓度（ 25、50 mmol.L^-1）的3AT（ 3-ami，2，4-triazole）缺陷型平板上，在30℃下培养3d，结果如表3和图3所示。阳性对照随着3AT浓度增加，生长率会降低，与阴性对照有明显差别。阴性对照由于HIS3报告基因未被激活，在添加3AT的平板上生长明显减少，随着3AT浓度升高，转化子数量减少。自激活检测结果显示，在不添加3AT时，平板上的生长菌落3 424个，在分别添加了25 mmol.L^-1和50 mmol.L^-13AT的平板上，转化子的生长明显受到抑制，其生长比例与阴性对照的生长比例基本一致，表明其未激活HIS3报告基因。当添加25 mmol.L^-13AT时，其生长受到抑制，菌落个数为408个，与对照的生长比例为11.9%，而当添加了50 mmol，L^-13AT时，其菌落个数为68个，与对照的生长比例为1.9%。因此，后续试验可以用50 mmol.L^-13AT进行。

2.5 cDNA文库的构建

将提取的干旱胁迫处理的香蕉总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4中显示，总RNA的28SrRNA和18S rRNA条带清晰，条带28S亮度约为18S的2倍，说明总RNA质量较好，并无发生降解和污染。将RNA进行mRNA分离纯化，如图5所示，mRNA条带呈弥散状分布，分布均匀，mRNA总量为4.5 μg，可以满足建库需要。

使用同源重组的方法，将线性化的香蕉cDNA与经酶切处理线性化的pGADT7-Rec2（单杂交）载体混合共转化至大肠杆菌感受态中，取原液稀释后涂布于LB平板上（含氨苄抗性），第2d计数，如图6所示，插入片段集中在500～2 000 bp，平均插入片段大于1 200 bp，阳性率为l00%。在10 μL菌液稀释100倍后，取10 μL涂板，共生長了约250个克隆，其库容量为2.5×10⁶CFU.mL^-1，共计5 mL的转化后原始菌液，则总库容量为1.25×10⁷CFU。

3 讨论与结论

香蕉是大水大肥作物，干旱胁迫严重影响其生长发育及品质。目前的研究表明，水通道蛋白基因（AQP）作为膜蛋白能够增加植物的水分运输能力，提高植物的耐旱性。在拟南芥中，将AtPIPI：2和AtPIP2; 2沉默会降低拟南芥抵御干旱的耐受性[13-14]。在水稻中过表达OsPIP1、OsPIP2和OsPIPl;3能够增强植物对干旱胁迫的耐受性[15-16]。在烟草中过表达TaAQP7和TaAQP8可以提高植物对干旱的耐受性[3，9]。因此，研究AQP响应干旱胁迫的作用机制，对于进一步通过生物技术提高香蕉的耐旱能力具有重要的理论意义。本研究通过克隆干旱胁迫下的香蕉cDNA，构建用于酵母单杂交的cDNA文库，通过克隆香蕉水通道蛋白基因MaAQP1启动子，构建酵母诱饵表达载体，为下一步利用酵母单杂交筛选与香蕉MaAQP1互作的转录因子奠定了基础。

启动子在时间和空间意义上对于启动基因转录和调节基因表达都很重要。靶向基因及其启动子的遗传修饰可用于增强作物生长性能[17]。顺式元件与转录因子（ TFs）之间的相互作用在转录的协调调控中对激活或抑制靶基因的表达起关键作用[18-19]。目前，可用于作物遗传改良的启动子很少。植物中最常见的启动子类型是35 s启动子CaMV35S，它可以在标记植物中驱动高水平的基因表达，而玉米泛素启动子则在单子叶植物中驱动基因表达。这些启动子能够在几乎所有组织和发育阶段的标志物或单子叶植物中驱动高水平的基因表达[20-22]。在特定条件下或某些组织中，诱导型或组织特异性启动子调节靶基因的表达。迄今为止，已经报道了一些植物的组织特异性和胁迫诱导型启动子。例如，拟南芥中的rd29A和rd29B启动子对高盐度和干旱有反应[23]。在小麦中，Dreb2启动子响应干旱胁迫[24]。来自芥菜植物的BjSOS2基因启动子在高盐，干旱和非生物胁迫以及其他形式的胁迫下起作用[25]。硬粒小麦基因TdPIP2; I水稻及其启动子区域响应非生物胁迫[26]。本研究通过PlantCARE应用程序分析了MaAQP1启动子的顺式作用元件，元件包含了多个TATA-box和CAAT-box核心元件，以及与ABA和MejA响应，MYB，MYC和光响应相关元件。TATA盒是在转录起始位点表达基因的核心启动子元件。CAAT-box是具有增强子活性的启动子中常见的顺式作用元件。但是，在MaAQP1启动子中未发现与干旱胁迫相关的反应元件。本研究发现ABRE是脱落酸（ABA）的顺式作用元件。研究表明ABA是一种重要的植物激素，参与许多重要的生物过程和反应，包括非生物胁迫。启动子的克隆及元件分析为下一步运用酵母单杂交鉴定直接调节MaAQP1启动子的转录因子，以及靶向转录因子调节MaAQP1表达的分子机制奠定了基础。

酵母单杂交cDNA文库的构建是酵母单杂交试验进行的基础，文库的质量好坏直接影响筛库过程。而cDNA文库的质量又是由转录成cDNA的mRNA决定的，因此必须对其质量进行严格的把关。本研究利用CTAB法提取香蕉组织RNA，RNA条带清晰无降解，进一步利用试剂盒分离纯化mRNA，合成香蕉cDNA，构建的cDNA文库，符合进一步试验的要求。另外，库容量以及插入片段的大小也直接影响到后期利用cDNA文库进行互作基因筛选的效率及结果，相关的研究表明，构建的木薯cDNA文库库容为1.5×10⁶CFU，插入片段大小为250～3 000 bp，能够为进一步的酵母单杂交筛选奠定良好的基础[27]。在本研究中，构建的文库库容为1.25×10⁷CFU，插入片段平均在1 200 bp左右，完全满足试验的要求。

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（责任编辑：张梅）

作者简介：许奕（1985-），女，硕士，研究方向：作物遗传育种（E-mail： lukydog163@163.com）

通信作者：李敬阳（1976-），男，硕士，副研究员，研究方向：作物遗传育种（E-mail： jingyanglee@163.com）