铁皮石斛DoLIS基因克隆与荣莉酸甲酯诱导表达分析

林江波 邹晖 王伟英 戴艺民

摘要：【目的】克隆铁皮石斛（Dendrobium officinale）芳樟醇合酶（linalool synthase，LIS）基因，分析该基因在铁皮石斛开花期花、叶、茎和根中的表达及茉莉酸甲酯（ Methyl Jasmonate，MejA）诱导表达模式，以期为进一步鉴定其功能及分析铁皮石斛单萜类代谢机制奠定基础。【方法】利用RACE-PCR和RT-PCR技术克隆DoLIS基因全长cDNA序列和开放阅读框（open reading frame，ORF），利用ProtParam和BLAST P在线软件进行理化性质分析和氨基酸同源性比对，采用MEGA 6.O构建系统进化树。利用qPCR方法分析DoLIS基因在开花期铁皮石斛花、叶、茎和根中的表达及MejA处理后叶片中的表达模式。【结果】DoLIS基因cDNA序列全长2 844 bp，含有1个2 538 bp的ORF，编码845个氨基酸。分子量为98.298 kD，理论等电点为7.04，不稳定系数是46.29，属不稳定蛋白。DoLIS蛋白具有Terpene_cyclase_plant_CI保守结构域。系统进化分析表明，DoLIS与其他物种的（S） -（+）-LIS聚在同一支，与姬蝴蝶兰（ XP 020576697）的LIS亲缘关系最近。qPCR分析结果显示，DoLIS基因在铁皮石斛开花期叶片中的相对表达量最高，在MejA处理后相对表达量呈先上升后下降的趋势，处理后5h相对表达量达到最高，是诱导前的3.88倍。【结论】本研究克隆了铁皮石斛DoLIS基因cDNA全长，该基因在叶片中的相对表达量极显著高于花、茎和根中的表达量。MejA处理能显著诱导DoLIS基因的表达。

关键词：铁皮石斛;芳樟醇合酶;基因克隆;表达分析;茉莉酸甲酯

中图分类号：S 567

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（ 2020） 10-1071-07

0 引言

【研究意义】芳樟醇，又称伽罗木醇、沉香油醇、沉香醇等，具有抗菌、镇静和杀虫等功效[1-5]。芳樟醇是一种单链状单萜醇，具有（R） -（一）一芳樟醇和（S）一（+）一芳樟醇2种对映异构体，两者气味有所差异[6]。不同植物两种对映异构体含有比例不同，薰衣草（Lavendula angustifolia）、依兰（Canangaodorata）、马鞭草（Verbena officinalis）等以（R） -（一）.芳樟醇为主，铃兰（Convalaria majalis）、迷迭香（Rosmarinus officinalis）和甜橙（Citrus sinensis）等以（S）.（+）.芳樟醇为主[7]。芳樟醇合成酶（ linaloolsynthase，LIS）催化底物栊牛儿焦磷酸（GPP），转化成（R） -（一）.芳樟醇或（S）.（+）.芳樟醇[8]。【前人研究进展】目前，已经从柠檬薄荷（Menthacitrata）[9]，金桂（Osmanthus fragrans）[10]、阔叶薰衣草（Lavandula latifolia）[11]，小苍兰（Freesia）上[12]分离到芳樟醇合成酶基因。刘偲等[13]克隆了桂花（Osmanthus fragrans）‘莲籽丹桂芳樟醇合酶基因OfTPS5，其表达量昼升夜降，在盛花期表达量最高。MeJA是与抗逆性相关的信号分子，通过信号转导激活或抑制植物次生代谢产物关键酶基因的表达，调控次生代谢产物的生物合成[14]。韦荣昌等[15]研究表明MejA促进罗汉果甜苷V代谢途径关键酶基因SQS和CS的表达，抑制CAS的表达。王启等[16]等研究结果表明MejA诱导微型月季特定萜类合成相关基因的表达。彭亮等[17]对MejA处理后的远志幼苗进行转录组测序，获得与三萜合成相关的关键酶基因59条，其中AACT、MK、SE和β-AS等12个基因上调表达。【本研究切人点】铁皮石斛（Dendrobiumofficinale）是中国传统名贵中药材，霍昕[18]等在铁皮石斛茎和叶挥发油中都检测到芳樟醇，相对含量分别为1.738%和1.284%。付涛等[19]提取铁皮石斛试管苗不同部位挥发油，结果表明，芳樟醇占茎挥发油相对含量的0.77%，叶和根的挥发油没有芳樟醇。邹晖等[20]提取铁皮石斛原球茎和花的精油中都含有芳樟醇，相对含量分别为3.57%和1.21%。目前，未见铁皮石斛芳樟醇合酶基因的相关研究报道。【拟解决的关键问题】本课题组根据转录组测序获得的铁皮石斛芳樟醇合成酶带5'末端的cDNA序列设计3 'RACE引物，采用RT-PCR技术克隆全长cDNA序列和ORF，分析芳樟醇合成酶基因在铁皮石斛开花期不同器官中的表达及茉莉酸甲酯（ methyljasmonate，MejA）诱导表达模式，以期为进一步鉴定基因功能及分析铁皮石斛单萜类代谢机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 試验材料和试剂

试验材料为冠豸山种源铁皮石斛，种植于福建省农业科学院亚热带农业研究所资源圃。取开花期铁皮石斛的花、叶、茎和根。用100 μ9.mL^-1茉莉酸甲酯（ MejA）喷雾铁皮石斛叶片，取喷雾后2、5、8h的叶片。样品用液氮速冻后，-70℃保存。

Escherichia coli DH Sa由本实验室保存;SteadyPure植物RNA提取试剂盒和SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司;反转录试剂盒PrimeScriptrM Reverse Transcriptase和克隆载体pMD19-T购自宝日医生物技术有限公司;DiaSpin柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒和San Taq PCR Mix预混液购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1总RNA提取和cDNA第1链合成按照SteadyPure植物RNA提取试剂盒的操作说明书提取总RNA，参照PrimeScript rM Reverse Transcriptase反转录试剂盒的操作说明，用随机引物逆转录合成cDNA第1链。取10 μL花、根、茎和叶的cDNA混合，用于全长cDNA和ORF的克隆。

1.2.2 DoLIS基因全长cDNA克隆 设计3 'RACE引物3LIS-F1、3LIS-F2和3 'adaptor引物dT-adapt、adapt（表1，下同）。以3LIS -F1和dT-adapt进行第一轮PCR，引物3LIS -F2和adapt进行巢式PCR，PCR程序：94℃预变性5min;94℃变性30s，52℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环;72 CC延伸10 min。PCR产物经回收、与pMD19-T连接后转化DH Sa感受态细胞，涂布于带氨苄霉素（Ampicillin）抗性平板后37℃培养过夜，挑取单克隆进行PCR鉴定，鉴定为阳性的克隆送去测序。引物合成和测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.3 DoLIS基因ORF克隆 根据全长cDNA序列信息设计引物DoLIS-F（带EcoRI酶切位点）和DoLIS-R（带Xho I酶切位点），以2μL混合的cDNA为模板，用引物DoLIS-F和DoLIS-R进行PCR扩增。PCR反应程序为：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经胶回收、克隆后测序。提取经DNAMAN V6.0比对正确的阳性克隆质粒pMD19-T-Do//S，-20℃保存。

1.2.4 DoLIS基因生物信息学分析 利用ProtParam预测蛋白质产物的理化性质。通过NCBI的BLASTP在线比对，搜索氨基酸保守结构域和同源性较高的其他物种的氨基酸序列，采用MEGA 6.0（NeighborJoining Tree， Bootstrap 1000）构建系统进化树[21]。

1.2.5 DoLIS基因表达分析 用超微量紫外可见光分光光度计（ ND-IOOO）将铁皮石斛各样品cDNA第1链质量浓度定量为200 ng.μL^-1。根据已经获得的DoLIS基因全长cDNA序列设计引物LIS-F和LIS-R，扩增长度为30lbp。以铁皮石斛Actin为内参基因，引物为DoACT-F和DoACT-R，产物长度为215 bp。根据SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒的说明书进行实时荧光定量PCR扩增（Roche LightCycler96）。反应体系20 μL：cDNA模板2μL，SYBR GreenPro Taq HS 10 μL，上、下游引物各1μL，ddH2O补至20 μL。反应程序：95℃预变性30 s;95℃变性10 s，61℃退火20 s，50个循环，每个处理设置3个生物学重复，3次技术性重复。

2 结果与分析

2.1 DoLIS基因全长cDNA克隆

以铁皮石斛混合cDNA第1链为模板，经二轮的PCR扩增，获得1条约600 bp的清晰条带（图1-A），PCR产物经过克隆和测序，测序结果利用DNAMAN V6.0进行序列拼接，结果表明获得目的基因的3 '末端，cDNA全长2 844 bp（图2），含有一个2 538 bp的ORF，编码845个氨基酸，5'末端非翻译区58 bp，3 '末端非翻译区248 bp。

2.2 DoLIS基因ORF的克隆

以混合cDNA为模板，利用引物DoLIS-F和DoLIS-R进行PCR扩增，PCR产物电泳结果（图1-B）显示，在2 603 bp左右有1条亮带，大小与预测的DoLIS基因ORF -致。PCR产物经过克隆和测序，结果表明获得了带EcoR I和Xho I酶切位点的DoLIS基因ORF。提取质粒pMD19-T-Do//S，-20℃保存，供进一步试验。

2.3 DoLIS的生物信息学分析

DoLIS蛋白的分子量为98.298 kD，带正电荷氨基酸（ Arg、Lys） 109个，带负电荷氨基酸（Asp、Glu） 111个，理论等电点为7.04，不稳定系数是46.29，属不稳定蛋白。

使用BLAST P在线检索结果表明，DoLIS蛋白具有Terpene_cyclase_plant_C1保守结构域，E值为4.85×10^-55，氨基酸序列与姬蝴蝶兰（Phalaenopsisequestris，XP一020576697）和非洲油棕（Elaeisguineensis，XP一019708546）的LIS氨基酸序列相似度分别为62%、46%。将DoLIS蛋白的氨基酸序列与其他13个物种的LIS氨基酸序列进行系统进化分析，结果（图3）表明，LIS分为（R） -（一）-LIS和（S） -（+） -LIS两大分支，铁皮石斛DoLIS与（S）.（+）.LIS聚在同一支，与姬蝴蝶兰（XP一020576697）的LIS亲缘关系最近，推测其属于（S） -（+）-LIS。

2.4 DoLIS基因在不同器官的表达

利用荧光定量PCR法检测铁皮石斛开花期的花、茎、叶和根中DoLIS基因的相对表达量，结果如图4所示，花、茎、叶和根中都能检测到DoLIS基因的表达，在叶片中的相对表达量最高，与花、茎和根的差异达到极显著，花、茎和根之间相对表达量差异不显著。

2.5茉莉酸甲酯对DoLIS基因表达的影响

利用荧光定量PCR法检测铁皮石斛叶片经100μg.mL^-1MejA喷雾处理2h、5h、8h后DoLIS基因的相对表达量，结果如图5所示，MejA能诱导铁皮石斛DoLIS基因的表达，呈先上升后下降的趋势。DoLIS基因在MejA处理后5h的相对表达量达到最高，是诱导前的3.88倍，随后表达量开始下降，处理后8h回落到正常水平。

3 讨论与结论

芳樟醇主要通过甲基赤藓糖醇磷酸（Methylerythritol 4-phosphate，MEP）途径合成[22]。萜烯合酶是芳樟醇等单萜类物质合成的限速酶[23]。本研究克隆了铁皮石斛DoLIS基因，DoLIS蛋白具有Terpene_cyclase_plant_C1保守结构域，与其他物种的（S） -（+）-LIS聚在同一支，推测其属于（S）.（+）.LIS。萜烯合酶功能复杂，同一种酶可以催化相同底物形成多种产物，也可以催化不同底物形成不同产物。YUE等[24]克隆了2个姜花的萜烯合酶基因HcTPS7and HcTPS8，HcTPS7催化GPP除了生成主要产物桧烯外，还可生成其他9种单萜副产物;HcTPS8催化GPP形成特異性产物芳樟醇，还可以催化法尼基二磷酸（FPP）合成α-香柑油烯，顺式-a-红没药烯，β-.金合欢烯和其他10个倍半萜。GREEN等[25]克隆了猕猴桃萜烯合酶基因AcNES1，能够催化FPP和GPP形成倍半萜产物橙花叔醇和单萜产物芳樟醇。本研究克隆的DoLIS具有哪些催化活性还有待进一步的研究。

LIS是单萜类化合物芳樟醇合成限速酶。//S基因在仙女扇、金桂的雌蕊、雄蕊和花瓣中都有表达，而叶片和花萼中不表达[10，26]。小苍兰的花瓣、雌蕊、雄蕊和叶片都能检测到LIS基因的表达，花瓣中的表达量最高[12]。铁皮石斛DoLIS基因在根、茎、花和叶中都能检测到表达，叶片中的表达量最高。MeJA是植物次生代谢的重要信号分子，张文娟等[27]研究结果表明，MeJA可以上调三萜类代谢途径关键酶基因HMGR、SQS和FPS的表达，相应的总三萜含量也明显提高，但3个基因表达模式存在差异。本研究结果发现，MejA能上调DoLIS基因在铁皮石斛叶中的表达，在100 μg.mL^-1MejA处理后Sh的相对表达量达到最高，是诱导前的3.88倍。MeJA上调铁皮石斛DoLIS基因的表达是否促进铁皮石斛单萜类物质芳樟醇的积累有待进一步的分析。

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（责任编辑：林海清）

作者简介：林江波（1976-），男，硕士，副研究员，研究方向：农业生物技术（E-mail： 345953257@qq.com）

通信作者：戴艺民（1969-），男，博士，研究员，研究方向：农业生物技术（E-mail： dymttcn@163.com）