PERK介导细胞应激反应的分子机制研究进展

张冲冲 ，宋伦

1.军事科学院 军事医学研究院 军事认知与脑科学研究所，北京 100850；2.河南大学 基础医学院，河南 开封 475004

机体代谢网络需要对摄入的各种形式的能量（脂肪、糖和蛋白质）做出适应性反应，以保证生命活动的正常进行，否则往往会引发炎症效应和细胞应激反应[1]。内质网（endoplasmic reticulum，ER）在维持细胞和生物体稳态、协调机体代谢网络适应性中具有关键作用[2]。

1 内质网应激和PERK

作为真核生物细胞内承载重要生命活动的细胞器，内质网不但在蛋白质合成、折叠和加工分泌方面发挥不可替代的作用，还介导钙离子的储存。在正常生理条件下，蛋白质合成、加工等过程在内质网内部有条不紊地进行着[3]。内质网膜上3个感应蛋白——蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、活化转录因子 6（activating transcription factor 6，ATF6）和需肌醇酶 1（inositol requiring enzyme 1，IRE1）——与内质网腔的葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein，GRP-78；又称binding immunoglobulin protein，BiP）处于结合状态。然而，当遭到损伤刺激时，许多错误折叠和未折叠的蛋白质在内质网堆集，内质网内部失去平衡，引发内质网应激（ER stress，ERS）。常见损伤刺激，如营养缺乏、缺氧、pH失衡或受到毒性物质刺激等，均能使蛋白质的加工处理功能减弱或造成钙离子平衡的破坏。

PERK基因全长约70 kb，含有19个外显子，位于人类染色体2p11.2，编码的PERK蛋白由1116个氨基酸残基构成，相对分子质量125×103。PERK又称真核翻译起始因子2α激酶3，是一种具有管腔结构域和胞质激酶结构域的Ⅰ型跨膜蛋白。其官腔结构域是一个二聚域，在未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）中起着翻译调控核心的作用。内质网应激发生后，PERK的N端管腔结构域的低聚能促进其C端胞质激酶结构域在多个残基上的磷酸化，包括Thr982、Tyr619、Ser715和Ser1094位点。C端结构域具备丝/苏氨酸（Ser/Thr）激酶活性，能把γ磷酸化基团从三磷酸腺苷催化转移到蛋白底物的Ser/Thr残基上。真核生物翻译起始因子2α亚基（eukaryotic initiation factor 2α，eIF-2α）是PERK最重要的靶分子，其磷酸化修饰反应可导致蛋白质合成下调进而缓解ERS可能引发的损伤。另外，PERK还能诱导磷酸化核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）的产生。Nrf2是一种亮氨酸拉链型转录因子，可调节细胞氧化还原状态，并在UPR期间对细胞的存活发挥促进作用。

2 PERK介导基因毒应激的信号转导机制

基因毒应激（genotoxic stress）是指生物体暴露于各种有害的理化和内外环境因素之下，基因组DNA发生损伤进而诱导细胞凋亡的反应。当细胞经受过强或持续的有害因素刺激时，为维持机体稳态，ERS可激活细胞内凋亡信号进而引起细胞凋亡。PERK通路诱导凋亡时，涉及eIF2α、转录激活因子4（activating transcriptional factor 4，ATF4）、T细胞死亡相关基因 51（T-cell death-associated gene 51，TDAG51）、tribbles同源基因 3（tribbles homolog3，TRIB3）和钙调神经磷酸酶（calcineurin，CN），介导促凋亡效应，而凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）、Nrf2介导拮抗凋亡的保护效应。其中，PERK通过下游eIF2α/ATF4/CHOP信号介导凋亡反应的发生。其作用机制是：C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）一方面阻止介导凋亡保护效应蛋白Bcl-2、Bcl-xl等的表达，另一方面上调促凋亡蛋白Bax、Bid等的表达，诱导线粒体凋亡途径活化[4]；同时，CHOP还能提高TRIB3水平，抑制抗凋亡的蛋白激酶B（PKB/Akt）发生磷酸化，导致PKB失活进而触发细胞凋亡[5]。进一步研究发现，TRIB3可以负反馈调节方式促进细胞恢复正常功能，即与CHOP及ATF4反向结合进而对其转录活性加以抑制。然而条件改变，TRIB3水平在长期损伤刺激下却会反应性增高，导致凋亡的发生。

TDAG51是具有促凋亡特征的类普列克底物蛋白（pleckstrin）同源结构域家族成员。ERS信号激活后，PERK通过eIF2α的磷酸化修饰，实现对TDAG51的激活，提高Fas水平，导致T细胞走向凋亡。

此外，PERK还能与CN结合，促进FK506结合蛋白12.6（FK506-binding protein 12.6，FKBP12.6）与莱恩素（ryanodine）受体2（RyR2）复合物的分离，ER中Ca2+释放，由于膜电势梯度，Ca2+迅速移位至线粒体，破坏线粒体中Ca2+的平衡，从而引起凋亡反应[6]。

另一方面，PERK也能抑制凋亡，促进细胞生存。胱冬酶（caspases）是介导细胞凋亡反应的重要分子，它能与IAP结合进而导致凋亡被阻断。ERS期间，当细胞达到临界应激水平时，PERK能选择性诱导IAP家族蛋白，从而抑制细胞凋亡的发生。另外，PERK还可通过诱导磷酸化Nrf2（p-Nrf2）保护细胞存活[7]。氧化应激反应发生时，PERK可直接诱导p-Nrf2的产生，打破Nrf2和Keap1（Keleh-like ECH-associated protein 1）的结合状态[8]。随后Nrf2激活抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）依赖基因，编码产生一系列抗氧化和细胞保护蛋白，如血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1），发挥抵抗炎症和细胞凋亡保护效应[9-11]。研究表明，Nrf2的抑制加重了ERS和凋亡，而Nrf2的过表达降低了CHOP的水平，保护细胞不发生凋亡，这揭示了Nrf2除了激活下游分子抑制凋亡外，还有可能影响介导凋亡发生相关蛋白的表达，发挥凋亡保护作用[12]。

3 PERK介导代谢应激的信号转导机制

3.1 PERK对脂类代谢应激的调节

PERK可参与调控脂类合成、分解氧化以及分泌和转运，调节脂类的代谢进程。

ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citratelyase，ACLY）、乙酰辅酶A羧基化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）等在脂肪酸的合成反应中起着重要的催化作用，PERK可通过调节FASN、ACLY的表达参与调控脂肪酸合成过程[13]。

固醇调节元件结合蛋白（sterol regulating element binding protein，SREBP）位于内质网，不仅调控胞内胆固醇浓度，也能对脂肪酸及甘油三酯的合成进行控制。它的3个成员（SREBP2、SREBP1c和SREBP1a）分别调节胆固醇合成关键酶羟甲戊二酰辅酶A还原酶（hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR）、低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）、FASN等脂代谢相关基因的表达[14-18]。ERS对脂类代谢的影响主要是通过链接SREBP而实现的[14]。Pro-SREBP不具备活性，其激活反应在高尔基体内进行，而转运SREBP的过程必须与SREBP裂解活化蛋白（SREBP-cleavageactivating protein，SCAP）结合形成复合体，由SCAP承担转运的作用[19]。而当细胞中胆固醇过量时，过量胆固醇优先与ER膜的SCAP蛋白以及驻留分子胰岛素诱导因子（insulin induced gene，Insig）结合，致使SREBP驻留在ER中。ERS可以激活PERK-eIF2α途径进而抑制Insig-1蛋白合成，SCAP得到解离，重新转运SREBP至高尔基体中发生水解反应，影响脂肪酸和胆固醇的生成[13,20]。

除此之外，PERK-eIF2α途径可通过促进C/EBPα/β蛋白的翻译，上调脂肪代谢因子PPARγ的水平和脂肪生成，导致肝内脂质累积[21-22]。另有对小鼠的研究指出，在白色脂肪组织中，ATF4介导脂肪生成基因的表达，不仅促进脂肪酸的合成，还能负向调节脂肪动员，揭示了PERK可能经由ATF4介导脂肪代谢的新机制[23]。

PERK也能参与脂质转运和分泌。内源性甘油三酯主要依靠极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）参与转运。而PERK能直接抑制后者的重要成分ApoB100的合成反应，导致脂肪无法被转运而滞留于肝细胞，诱发肝脂肪变性[24]。有趣的是，Jo等发现PERK-ATF4还能介导VLDL受体VLDLR的表达，刺激细胞内甘油三酯的积累，引起肝脏脂质沉积。

3.2 PERK对糖代谢应激的调节

胰岛素抵抗是指多种因素引起的胰岛素提高葡萄糖摄取和利用效率的降低，主要表现在肝、肌肉与脂肪组织等靶器官或靶组织对胰岛素的反应能力下降。ERS与代谢疾病密切相关，是引起胰岛素抵抗和Ⅱ型糖尿病的重要诱因[25-26]。PERK/eIF2α途径活化可上调C/EBP水平，进而激活Forkhead转录因子FoxO1并上调糖异生反应限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）表达，使葡萄糖含量升高，这是Ⅱ型糖尿病的常见原因。现已证实，肥胖可以导致脂肪组织和肝脏内质网应激，进而诱发Ⅱ型糖尿病[2]。

肥胖状态下,肝脏中PERK-eIF2α-ATF4通路活化并上调TRIB3表达,后者可与肝脏p70 S6激酶（hepatic p70 S6 kinase，S6K1）联合作用，通过胰岛素受体底物1-磷脂酰肌醇3激酶途径抑制AKT的磷酸化，致使胰岛素抵抗的发生[27-28]。有实验表明，对小鼠进行高脂饲料喂养诱导肥胖效应后，PERK和CHOP蛋白表达显著增高，致使血清胰岛素水平和肝脏脂质沉积增加。

然而，PERK也能通过eIF2α参与调控肝脏的糖异生过程，改善胰岛素抵抗和糖代谢水平。这是由于小鼠肝脏中特异性过表达GADD34，形成的GADD34-PP1c复合物促进了p-eIF2α的去磷酸化反应[29-30]。

4 PERK介导炎性应激的信号转导机制

内质网应激与多种炎性因子的产生具有密切联系。核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）在近乎所有类型细胞中广泛存在，在炎性反应中发挥重要作用。其靶基因包括肿瘤坏死因子α（tumor nccrosis factor，TNF-α）、多种白细胞介素（interleukin，IL）和黏附分子等60多种。经典途径的NF-κB活化反应须经历p65∶p50异二聚体与NF-κB抑制因子IκB（inhibitor of NF-κB）之间的解离反应，此后NF-κB快速移至细胞核，与靶基因启动子区的特异性κB序列发生结合反应，促进炎性应激相关分子的转录。在此过程中，PERK活化能抑制包括IκB在内的蛋白质的翻译反应，解除IκB对NF-κB的抑制作用，促进NF-κB移位至核内进而发生激活。另外，PERK能引起TRIB3等与应激有关蛋白的过表达，直接作用于NF-κB并促进其活化[31]。另有研究表明，CHOP敲除后，小鼠白色脂肪组织中的巨噬细胞极化成M2型，炎症因子的表达减少，慢性炎症反应被抑制，说明PERK也能通过下游CHOP促进炎性因子的产生，进而介导炎性反应[32]。

细胞质中炎性因子IL-1β、IL-18未经修饰的前体形式是无活性的，需要借助炎性小体，使得Caspase-1自我剪切并活化，裂解Pro-IL-1β、Pro-IL-18，才能成熟和分泌。而PERK能通过诱导硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP），促进 NLRP3 炎性小体的表达[33]；也有研究指出，PERK通路的下游产物ATF4能直接与炎性小体NLRP1的启动子结合，促进其表达，进而促进炎性相关分子的成熟和分泌[34]。

5 结语

内质网是最为精细和复杂的膜系统，蛋白质合成加工、糖脂合成及转运等生命活动均需依托于内质网才能正常进行。作为ER应激三大感应蛋白之一，PERK在介导细胞凋亡、参与机体营养和代谢调节以及调控炎症反应方面具有重要意义。但有关PERK的细胞应激反应调节机制的研究还远远不足。目前，有关ER应激偶联自噬反应机制是PERK领域的研究热点，这一方向的新发现将为解释PERK介导基因毒应激、代谢应激和炎性应激功能提供更多依据。同时，PERK信号网络的研究也在逐步深入。尤其是PERK不依赖内质网应激条件发挥代谢调节功能的发现，体现了PERK本身作为调节因子，能独立发挥调控作用，这也将成为未来解释PERK多功能性的新视角[35]。