羊传染性胸膜肺炎支原体RPS11 基因的原核表达及间接ELISA 检测方法的建立

王 璇，吴玙彤，潘淑惠，黄 波，高明琴，文正常

（贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵阳 550005）

近年来，随着我国肉羊养殖数量及养殖规模的不断增大，频繁的跨区域引种及大量的活羊、肉品的市场交易和流通，因受长途运输应激、不同季节和地域气候特性、饲养管理方式的差异等不利因素的影响，导致羊传染性胸膜肺炎（infectious pleuropneumonia of sheep and goats）的发生变得更加频繁，其流行区域及范围更加广泛，已成为一种危害国内肉羊养殖生产的主要常发条件性传染病，严重影响肉羊产业的健康可持续性发展[1-3]。该病潜伏期较长，当临床症状显著时往往处于发病晚期，给治疗带来困难。由于肉羊养殖产业的特殊性，目前国内肉羊专业规模化养殖相对滞后，大部分地区仍以农户小规模分散养殖为主，其分布主要在交通相对欠发达的边远山区，无论从养殖设施条件、规范化养殖生产技术的应用，到早期特异性检测诊断技术手段等，都难以满足该病有效防控的技术条件及要求[4-6]。

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是羊传染性胸膜肺炎的主要致病源，研究表明，RPS11是绵羊肺炎支原体的重要抗原[7-9]。RPS11是参与核糖体构成的重要亚单位，核糖体蛋白质（ribosomalprotein，RP）在进化过程中高度保守，在哺乳动物中其氨基酸序列均相同，在原核细菌、真菌和酵母中也极其相似。RP是一种RNA结合蛋白，与核糖体RNA共同参与蛋白质的合成。其功能是组装、稳定rRNA，协助rRNA完成译码功能。根据来源的大小亚基RP分别被命名为RPL和RPS。RPS11能刺激机体产生相对较强的免疫反应。本研究根据羊传染性胸膜肺炎支原体分离株（GM01株）全基因序列设计引物，经PCR扩增RPS11基因片段，构建重组质粒pET28a-RPS11，表达、纯化重组蛋白RPS11，并对其免疫原性进行鉴定；同时，以重组蛋白RPS11为包被抗原建立间接ELISA检测方法，为羊传染性胸膜肺炎的早期诊断、监测、免疫抗体效价检测及综合防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 菌种与主要材料羊传染性胸膜肺炎支原体分离株（GM01株）、高免血清由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究实验室分离鉴定保存和制备；羊口蹄疫、布鲁氏杆菌阳性血清购自青岛立见生物公司；阴性山羊血清购自广州蕊特生物科技有限公司；山羊传染性胸膜肺炎间接血凝检测试剂购自兰州兽医研究所；BamHI、XhoI购自NEB公司；Pfu DNA polymerase购自ThermoFisher公司；T4 DNA连接酶购自Fermentas公司；基因组DNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；质粒提取试剂盒购自Axygen公司；载体pET28a（+）、大肠杆菌TOP10感受态细胞购于大连宝生物；辣根过氧化物酶标兔抗羊IgG（Rbanti-Goat IgG/HRP）购于北京博奥森生物技术有限公司；邻苯二胺（OPD）购于BBI公司；YEAST EXTRACT、TRYPTONE购自OXOID公司；IPTG、硫酸卡拉素购自Amresco公司；Tris购自Solarbio公司；还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽）购自Merck公司；考马斯亮蓝G250购自上海沃凯化学试剂有限公司；精氨酸购自北京中科科奥生物科技有限公司；NaCl、EDTA·2Na、KH2PO4、Na2HPO4、NiSO4、磷酸等购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 引物设计与合成根据GenBank中登记的羊肺炎支原体16S rRNA中的保守序列（GenBank登录号：JFAD01000011），应用DNAStar软件设计特异性引物，上游引物M1：5"-TGGAGCGACACAGAGTGC AC-3"，下游引物M2：5"-GCTGTGCTAGTGACTTT T G C C-3"，扩增全长基因。再对该段基因的抗原表位集中区设计特异性引物，RPS11-F：5"-GGATCCATGGCAACTAATACTCGT-3"；RPS11-R：5"-CTCGAGCCTTTTTTCCTGACG-3"（下划线处分别为BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点），引物均由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。

1.3 PCR扩增按照细菌DNA基因组提取试剂盒说明提取GM01株的基因组DNA。以提取的DNA为模板，PCR反应体系50 μL：ddH2O 25 μL，2×PCR mix 20 μL，基因组DNA模板4 μL，上、下游引物各1 μL。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25个循环；72℃延伸10 min。胶回收目的条带，连至克隆载体，并转化至大肠杆菌Top10感受态细胞。

1.4 重组表达质粒的构建用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET28a和重组克隆质粒，回收目的基因，使用T4 DNA Ligase于16℃水浴锅孵育0.5～1 h；将连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，并涂布于LB固体平板，37℃过夜培养。待平板长出菌落，随机挑取若干个单个菌落，进行菌落PCR验证。菌液测序及验证送由测序公司完成。

1.5 重组蛋白RPS11的原核表达、鉴定与纯化

1.5.1 感受态转化及阳性克隆筛选 从超低温冰箱中取出Rosetta感受态细胞置于冰上融化；加入pET28a-RPS11质粒5 μg，轻轻吹吸充分混匀，冰浴30 min；水浴42℃热激90 s，冰上放置1～2 min；加入800 μL预热LB液体培养基，37℃ 5×g摇菌培养50 min；7 000×g离心4 min，去部分上清，取 150 μL体积菌液混匀后涂至卡那抗性平板上；倒置，37℃培养12～16 h可出现单菌落。

1.5.2 重组蛋白RPS11小量表达与鉴定 挑选含pET28a-RPS11重组质粒的单菌落至3 mL LB液体培养基中，37℃培养过夜后-20℃保种；分别挑选含pET28a-RPS11重组质粒的单菌落至3 mL LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.6；取部分菌液作为对照组，余下菌液加入终浓度1 mmol/L IPTG，37℃震荡培养3 h；分别取两组菌液0.15 mL、12 000×g离心2 min，菌体沉淀以40 μL、1×loading buffer重悬裂解，SDS-PAGE检测。

1.5.3 RPS11蛋白大量表达及破菌检测 取保存于-20℃的菌种100 μL接种于100 mL LB液体培养基中震荡培养过夜；取100 mL菌液接种于2000 mL LB液体培养基37℃扩大培养至OD600约0.6，降低培养温度到30℃；加入IPTG诱导剂至终浓度0.1 mmol/L、30℃继续震荡培养8 h；13 000 ×g离心3 min收集菌体，重悬于50 mL预冷NTA-0缓冲液中，冰浴30 min；超声破碎菌体，参数设置为功率200 W、工作3 s、暂停4 s、时间25～30 min，4℃条件下50 000×g离心 50 min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀进行SDS-PAGE检测，剩余上清及沉淀置于4℃备用。

1.5.4 RPS11包涵体蛋白纯化 沉淀以50 mL NTA-0缓冲液重悬，加入DTT至终浓度1 mmol/L；超声促进杂蛋白溶解（参数设置：功率200 W、工作3 s、暂停3 s、时间10 min），20 000×g4℃离心10 min，弃上清；重复以上步骤至上清透明。沉淀以PBS重悬、超声（参数设置：功率200 W、工作3 s、暂停3s、时间5 min），50 000×g4℃离心10 min，去上清；3 mL 6 mol/L盐酸胍重悬包涵体，加DTT至终浓度5 mmol/L、10×g37℃震荡3 h至包涵体全部溶解，4℃条件下200×g离心10 min，收集上清。

1.5.5 RPS11包涵体蛋白复性 以2倍体积的3 mol/L盐酸胍稀释蛋白溶液，4℃条件下逐滴加入到200 mL复性液（pH8.0）中，转速调节至最大，搅拌24 h，降低转速搅拌24 h；取蛋白溶液于透析袋中，以PEG 20 000浓缩体积至50～100 mL，4℃条件下PBS缓冲液中透析过夜，以PEG20 000浓缩体积至2～4 mL，4℃条件下PBS缓冲液透析过夜；取蛋白溶液进行SDSPAGE检测。

1.5.6 复性蛋白纯化 复性蛋白溶液用0.22 μm过滤器过滤备用； 按Ni-NTA柱料准备流程准备Ni-NTA柱；以1 mL/min的流速上样上清蛋白溶液；以 0.1 mol/L EDTA溶液洗柱至流出液不含蛋白；分别以20、60、200和50 mmol/L咪唑洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色；以3倍柱体积去离子水洗涤柱料，以20%乙醇封柱；对收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测。

1.6 间接ELISA检测方法的建立

1.6.1 抗原包被浓度及阳性血清稀释度的筛选 采用棋盘法，将纯化后的RPS11蛋白用0.05 mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液（包被液）分别稀释至4.0、2.0、1.0、0.51 μg/mL，取酶联反应板，4℃包被过夜，用200 μL PBST溶液洗涤3次，加入200 μL/孔0.05%脱脂奶的PBST溶液37℃封闭1 h，洗涤3次。每孔分别按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200，加入100 μL稀释的阴性、阳性血清，37℃孵育45 min；洗涤3次，按100 μL/孔加入辣根过氧化物酶标兔抗羊IgG，37℃作用30 min，洗涤5次；50 μL/孔加入显色液10 min；按50 μL/孔加入2 mol /L H2SO4终止液终止显色，于酶标仪OD450检测。根据OD450值计算相应的P/N值，选择阳性血清OD450接近于1.0，阴性血清对应孔OD450值接近于0.2，且其P/N值对应的最大值作为最佳反应条件，以确定抗原最佳包被浓度及阳性血清稀释度。

1.6.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定 以选定的抗原包被浓度和阳性血清稀释度，将酶标兔抗羊IgG分别按将1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、 1∶10 000稀释，比较各组OD450测定值，以P/N最大值为酶标二抗最佳工作浓度。

1.6.3 待检血清作用时间的选择 加入待检阳性血清，分别在37℃条件下孵育30、45、60、75、90、120 min后进行检测，比较各组OD450测定值以P/N最大值为最佳作用时间。

1.6.4 酶标二抗反应时间的优化 加入酶标二抗，分别在37 ℃条件下孵育30、45、60、75、90、120 min后进行检测，选定P/N最大值为二抗最佳反应时间。

1.6.5 TMB底物反应时间的选择 在选定条件下，加入TMB显色溶液37℃条件下分别孵育5、10、15、20、25 min，加入50 μL 2mol/L H2SO4终止反应，以P/N最大值为最佳反应时间。

1.6.6 临界值的确定及判定方法 用选定的最佳反应条件下建立的间接ELISA检测方法测定36份羊阴性血清OD450值，计算其平均值和标准差（s）；当OD450值≥即判定为阳性，OD450值即判定为阴性，值即判定为可疑。

1.6.7 特异性交叉检测试验 分别选择羊口蹄疫、布鲁氏菌阳性血清，应用建立的间接ELISA检测方法进行交叉检测，每份血清重复检测6孔，比较其特异性。

1.6.8 临床样本检测 应用建立的间接ELISA检测方法对从4个生产羊场采集的共180份临床非免疫血清样本进行检测，并与羊传染性胸膜间接血凝检测试验进行比较，计算符合率。

2 结果

2.1 PCR扩增结果以GM01株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收目的条带构建至克隆载体。结果显示，在402 bp处出现一条明显的条带，与预期大小相符合（图1）。

2.2 重组质粒构建及鉴定重组克隆质粒以及pET28a经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，胶回收酶切产物，并链接构建pET28a-RPS11重组表达质粒。双酶切鉴定为阳性（图2），测序结果正确，表明重组表达质粒构建成功。

图1 RPS11 基因PCR 扩增产物Fig.1 PCR amplification products of RPS11 gene

图2 pET28a-RPS11 质粒双酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28a-RPS11 by restriction enzymes digestion

2.3 重组RPS11蛋白的原核表达、鉴定与纯化pET28a-RPS11表达蛋白经过超声波破碎、离心后，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳。结果显示，RPS11重组蛋白主要以包涵体的形式存在；包涵体蛋白经复性及Ni-NTA纯化处理后，获得了大小为19 kDa的RPS11重组蛋白3 mg，纯度＞85 %（图3）。

2.4 间接ELISA反应条件的优化从方阵试验结果可以看出，pET28a-RPS11重组蛋白抗原浓度为 1.0 μg/mL，血清的稀释度为1∶400时，阳性血清的OD450值在1.0左右，且阴性血清的OD450较低，P/N值最高（表1）。因此确定抗原最佳包被浓度为 1.0 μg/mL，血清最佳稀释度为1∶400。按上述条件继续进行后续条件筛选，根据P/N值的大小明确了血清最佳作用时间为45 min，酶标二抗最佳工作浓度为1∶4000，酶标二抗反应时间为30 min，底物显色为10 min。

图3 表达产物分析图Fig.3 The analysis of expression product

表1 重组蛋白抗原最适包被浓度与血清稀释度的确定Table 1 The optimization of coating concentration with RPS11 protein and serum concentration

2.5 临界值的确定在抗原包被浓度为1.0 μg/ mL，血清稀释度为1∶400条件下，对36份阴性血清进行检测（表2）。计算其平均值标准差s=0.047。故当OD450值≥0.386判定为阳性，OD450值≤0.339即判定为阴性，0.339＜OD450值＜0.386即判定为可疑。

表2 36 份阴性血清检测结果Table 2 Detection results of 36 negative sera

2.6 特异性交叉检测应用建立的间接LISA检测方法对羊口蹄疫、布鲁氏菌阳性血清进行检测，结果均为阴性，表明无交叉特异性反应。

2.7 临床样本检测应用建立的间接ELISA检测方法和间接血凝检测方法分别对180份生产场临床血清样本进行检测（表3）。结果表明，间接ELISA检测阳性率为35.00%，阴性率为65.00%；间接血凝检测阳性率为29.44%，阴性率为70.56%；两者间阳性符合率为94.34%，阴性符合率为89.76%，总符合率达91.11 %。

表3 180 份临床血清间接ELISA 与HI 试验检测结果Table 3 Detection results of indirect ELISA and HI test of 180 clinical goat sera

3 讨论

3.1 本研究通过贵州羊传染性胸膜肺炎支原体分离的GM01株全基因序列设计引物，扩增目的基因RPS11，构建重组表达质粒pET28a-RPS11，成功转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，诱导表达RPS11重组蛋白并鉴定及纯化。SDS-PAGE检测结果表明，经大肠杆菌表达系统表达的RPS11重组蛋白分子量正确，约为19 kDa，纯度为85%，具有良好的抗原性及特异性。

3.2 本研究基于原核表达的RPS11重组蛋白作为包被抗原建立的羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测方法，具有较好的检测敏感性和特异性；与羊传染性胸膜间接血凝检测方法相比，两者符合率达91.11%，与其他学者建立的间接ELISA检测符合率[10-13]的结果相符。该方法适用于基层兽医实验室开展血清学检测诊断及流行病学调查，也为诊断试剂盒的研发奠定了良好的技术基础。