禽白血病病毒ELISA 检测方法的建立与初步应用

曹利利，董 航，郭衍冰，姜 旭,，姚新华，苑淑贤，邵洪泽，宋建臣，贾立军

（1.吉林省畜牧兽医科学研究院，长春130062；2.延边大学农学院，延边 133000）

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leakosis virus，ALV）引起的禽类可传播良性和恶性肿瘤疾病的统称。自然条件下，最常见的是淋巴白血病，此外还有成红细胞增多性白血病、成髓细胞性白血病和髓细胞瘤病等[1]。本病在世界各地均有发生，感染率高，发病率低，是危害养禽业的主要疾病之一。禽白血病的危害主要表现为感染鸡群出现肿瘤病及慢性消耗性死亡、生长发育不良、生产性能下降和免疫抑制等[2]。ALV可分为A～J 10个亚型，其中可感染鸡的有A～E以及J亚型，E亚型是内源性病毒。外源性ALV具有较强的致病性，最常见的是A、B和J亚型，可造成严重的危害[3]。

目前，禽白血病的检测方法有很多，在这些检测方法中，ELISA适用于种群净化，具有快速灵敏，可大批量检测样品的特点。在我国，关于ALV的ELISA研究已经有很多。1987年，李厚达[4]首次用ELISA方法检测ALV；2010年，仇钰等[5]建立了检测鸡血清中抗ALV抗体的间接ELISA方法，该方法符合率比IDEXX公司生产的ELISA试剂盒符合率更高，并且可以检测到ALV所有亚群的抗体；2014年，刘丽娜等[6]将重组蛋白gp85作为包被抗原建立的间接ELISA检测法，与其他禽类病原没有交叉反应，具有良好的重复性。

p27蛋白是病毒的衣壳蛋白，在病毒总含量中占有较多，含有较多抗原表位，是ALV的群特异性抗原团[7]。因p27易于检测的特点，常运用ELISA方法监测p27抗原以达到净化鸡群的目的。本研究采用真核系统中表达的p27蛋白为包被抗原建立了检测ALV的间接ELISA方法并进行了初步应用研究。

1 材料与方法

1.1 材料p27重组蛋白纯化产物（毕赤酵母中表达），通过亲和层析柱纯化，由本实验研制并保存；ALV阳性血清与阴性血清、鸡传染性法氏囊阳性血清、鸡传染性支气管炎阳性血清、火鸡疱疹病毒阳性血清、鸡大肠杆菌阳性血清、沙门氏菌阳性血清均由本实验室采集并保存。

1.2 抗原包被浓度与血清稀释度的确定将p27重组蛋白分别以20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156 25 μg/mL共8个浓度进行包被，每孔100 uL，阳性血清和阴性血清稀释为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800的5个梯度，测OD490值，筛选出最适抗原包被浓度与血清最佳稀释度。

1.3 酶标抗体稀释度的确定在最适包被浓度的条件下，加入最适稀释度的ALV阳性血清及阴性血清，将酶标二抗稀释为1∶2,500、1∶5000、1∶10 000、1∶20 000共4个梯度，每孔100 μL，确定酶标抗体的最适反应浓度。

1.4 反应时间的确定在以上确定的最适条件下，分别筛选出待检血清的最适反应时间以及二抗的最佳反应时间，设立0.5、1、1.5、2 h的4个不同反应时间。为了确定显色液反应的最佳时间，设立5、10、15、20 min的4个不同反应时间。

1.5 临界值的确定随机选取没有禽白血病感染的鸡阴性血清20份，用建立的间接ELISA方法检测。计算OD490的平均值x，标准差SD，根据统计学原理x+3SD置信区间为99%，计算的值大于或者等于x+3SD即判定为阳性，反之判定为阴性。

1.6 特异性试验 用已建立的间接ELISA检测方法，对鸡传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）、马立克病毒（Marek"s disease virus，MDV）、新城疫病毒（Newcastle disease v i r u s，N D V）、禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）、传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）的禽类病毒性传染病病毒阳性血清、禽白血病阳性和阴性血清进行测定。

1.7 重复性试验用同一批次制备的蛋白包被酶标板，取阳性、阴性样品各3份进行ELISA检测，重复4次，在同样的反应条件下进行试验；取4个批次生产的ELISA酶标板，取阳性、阴性样品各3份进行ELISA检测，重复4次，在同样的反应条件下进行试验。对试验结果进行分析比较。

1.8 符合率试验用IDEXX商品试剂盒对80份疑似禽白血病的血清进行检测，以建立的ELISA方法做对比试验，确定ELISA检测方法的符合率。

1.9 临床样本检测用建立的ELISA方法对2016年10月采自吉林省长春市、吉林市、通化市、四平市、松原市、延边朝鲜族自治洲、白山市周边地区的19个养鸡场，共314份疑似ALV发病鸡的血清样本进行检测。

2 结果

2.1 反应条件的优化

2.1.1 最适抗原包被浓度与血清稀释度的确定 测定包被的不同浓度的p27重组蛋白与不同稀释度的血清反应的OD490值。结果显示（表1），当p27蛋白包被浓度为2.5 μg/mL，血清稀释度为1∶200时，P/N最大可达10.218 4，以此确定最佳抗原包被浓度与血清稀释度。

表1 最适抗原包被浓度与血清稀释度的确定Table 1 Determination of optimal antigen coating concentration and serum dilution

2.1.2 最适酶标抗体稀释度的确定 根据2.1.1的试验结果，选择1∶200稀释度的阳性和阴性血清，以4个梯度稀释酶标二抗进行浓度的筛选。当稀释度为1∶5000时，P/N值最大可达10.2177，以此确定酶标抗体的最佳稀释度，结果见表2。

表2 最适酶标抗体稀释度的确定Table 2 Determination of the optimal dilution of enzymelabeled antibody

2.1.3 最佳反应时间的确定

2.1.3.1 待检血清最佳作用时间的确定 根据2.1.1和2.1.2的试验结果，选择最佳稀释度的阳性、阴性血清以及酶标抗体，以4个不同反应时间进行待检血清最佳作用时间的筛选。可知，当血清作用1.5 h时，P/N值最大，以此确定待检血清最佳作用时间，结果见表3。

表3 待检血清最佳作用时间的确定Table 3 Determination of the optimal action time of the serum

2.1.3.2 酶标抗体最佳反应时间的确定 根据2.1.1和2.1.2的试验结果，选择最佳稀释度的阳性、阴性血清以及酶标抗体，以4个不同反应时间进行酶标抗体的最佳反应时间的筛选。当酶标抗体作用1 h时， P/N值最大，以此确定酶标抗体的最佳作用时间，结果见表4。

表4 酶标抗体最佳反应时间的确定Table 4 Determination of the optimal reaction time of the enzyme-labeled antibody

2.1.3.3 最佳显色时间的确定 根据2.1.1和2.1.2的试验结果，选择最佳稀释度的阳性、阴性血清以及酶标抗体，以4个不同反应时间进行最佳显色时间的筛选。当显色时间为12 min时，P/N值最大，以此确定最佳显色时间，结果见表5。

表5 最佳显色时间的确定Table 5 Determination of the optimal color development time

2.1.4 临界值的确定 按照以上优化的反应条件，用建立的间接ELISA方法对20份阴性血清进行检测，结果见表6。

表6 临界值的确定Table 6 Determination of the critical value

表7 间接ELISA 方法的特异性试验结果Table 7 Specific test results of indirect ELISA method

表8 间接ELISA 方法的批内重复试验结果Table 8 Intra-assay repeated test results of indirect ELISA

按照统计学方法，求得20份阴性血清样品的平均值x为0.1235，标准方差（SD）为0.0248，根据统计学原理x+3SD置信区间为99%。计算出ELISA阴性的临界值是x+3SD=0.1979，因此待测样品的OD490值≥0.1979为阳性；反之，则判断为阴性。

2.2 特异性试验以优化后的间接ELISA检测方法分别对禽类病毒性传染病阳性血清和禽白血病阳性、阴性血清进行测定。结果显示，除禽白血病阳性血清为阳性外，其他检测结果为阴性，说明建立的检测方法特异性良好，结果见表7。

2.3 重复性试验以优化后的间接ELISA检测方法分别对批内、批间（4个）各3份样品重复4次进行检测。结果显示，重复试验的变异系数均小于8%，说明建立的ELISA方法具有良好的重复性。检测结果见表8、9。

2.4 符合率试验为了进一步确定建立的ELISA检测方法与市售商品试剂盒之间的符合率，分别以上述两种方法对80份血清样本进行检测。结果显示，符合率达96.92%，且建立的方法更为敏感。结果见表10。

表9 间接ELISA 方法的批间重复试验结果Table 9 Inter-assay repeat test results of indirect ELISA

表10 间接ELISA 方法的符合率试验结果Table 10 Conformance test results of indirect ELISA method

2.5 初步应用以建立的间接ELISA检测方法分别对吉林省内6个市及1个自治洲周边地区的314份疑似ALV的鸡血清进行检测。结果表明，阳性样品总数为236份，阳性率为75.15%，其中四平市感染率最高。结果见表11。

3 讨论

我国地域广大，饲养的鸡群品种多、养殖方式也都有所不同。要减少或杜绝禽白血病对鸡场造成的损失，需要继续开展净化工作，从根本上对禽白血病进行有效防控。加强日常饲养管理，减少种鸡群的感染率和建立无白血病的种鸡群是控制本病的最有效方法[8]。家禽疫病诊断及检测技术的主要发展趋势是以高通量、快速、高特异性为主要方向，检测方法仍然以RT-PCR技术、单克隆抗体、ELISA、核酸探针技术为主[9]。ELISA检测方法因其具有敏感、简便、快捷、适用于样品数大检测等特点，在众多方法中脱颖而出，被广泛应用在种群净化 中[10]。本研究中作为包被的蛋白可以降低生产成本，建立的ELISA方法具有良好的特异性与重复性，敏感性与商品化试剂盒相比更高。

毛娅卿等[11]构建重组表达质粒pET28a-p27，在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达可溶性重组蛋白，纯化后免疫家兔制备抗血清，ELISA抗体效价达1∶25 600。本研究以酵母分泌表达的p27蛋白作为包被蛋白，毕赤酵母表达是真核表达系统，既可在胞内表达，又能进行分泌表达。有研究表明，相比于原核表达系统，该系统里表达的蛋白与抗体结合效果更强[12-13]。

表11 间接ELISA 检测临床血清样本检测Table 11 Detection of clinical serum samples by indirect ELISA

p27蛋白是群特异性蛋白，具有高度保守性，针对p27蛋白建立禽白血病的检测方法，可以有效减少因病毒突变而漏检的现象[14]。而以酵母分泌表达的p27重组蛋白既保证了与天然p27蛋白相似的结构和功能，还可以大量高密度发酵，降低制备成本。本研究以此蛋白为包被抗原建立ELISA检测方法，对于动态监测禽白血病流行病学情况，科学合理开展净化工作意义重大，也为禽白血病基础研究以及防治奠定了基础。