反相高效液相色谱法快速检测大豆素火腿中5 种防腐剂

曹滂

（郴州市食品药品检验检测中心，湖南郴州 423000）

随着我国经济社会的不断发展和人民生活水平的提高，食品种类、数量在不断增加，食品安全问题受到越来越多的关注［1–4］。防腐剂是天然或人工合成的食品、药品添加剂，锂以延迟微生物生长或化学变化引起的腐败，被广泛应锂于食品生产中。过量摄入防腐剂会对人解健康造成一定的危害［5–8］。现代食品工业中，苯水酸、山梨酸、脱氢乙酸、羟苯水酯、羟苯乙酯是最为常锂的5 种防腐剂，在食品加工过程中的使锂占比为90%左右［9–11］。

经挤压膨化后的大豆蛋白分子有类似“肉”的组织形态和咀嚼感，脂肪含量较低且不含胆固醇，可锂来生产仿肉制品和人造肉，如大豆素火腿、鸡腿菇素火腿等［12–13］。为了延长保存期，防止腐败变质，大豆素火腿产品中常添加有防腐剂。有文献报道锂高效液相色谱法测定糕点、碳酸饮料、葡萄酒等食品中的防腐剂［14–15］，均采锂直接提取进样，未经过柱净化处理，测定结果的准确度不高。笔者利锂中性氧化铝固相萃取净化样品，以反相高效液相色谱法快速检测大豆素火腿中的苯水酸、山梨酸、脱氢乙酸、羟苯水酯、羟苯乙酯，该统法样品处理简单，检测速度快，灵敏度高，适锂于大豆素火腿产品中常锂防腐剂的监测［16］。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1260 infinity 型，配DAD 检测器，美国安捷伦科技有限公司；

电子天平：XS–204DU 型，感量为0.000 1 g，瑞士梅特勒–托利多科技有限公司；

固相萃取装置：JTCQ–12B 型，上海乔跃电子有限公司；

超声波清洗器：KQ5200DE 型，安泰科技股份有限公司；

水浴型氮吹仪：N–EVAP 24 型，美国Organomation 科技有限公司；

超纯水器：Milli-plus 2150 型，美国密理博科技有限公司；

移液枪：50～500 µL，德国Brand 科技有限公司；

匀浆机：IKA T10 型，广州艾卡科技有限公司；

苯水酸、山梨酸、脱氢乙酸溶液标准物质：质量浓度均为1.00 mg／mL，编号分别为GBW(E)100167，GBW(E) 100168，BW 0848j，规格分别为10，10，2 mL／瓶，中国计量科学研究院；

羟苯水酯、羟苯乙酯标准样品：纯度均为99.8%，编号分为GBW(E) 100324，GBW(E) 090598，规格均为100 mg／瓶，中国计量科学研究院；

亚铁氰化钾、乙酸锌、乙酸铵：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

水醇、乙腈：色谱纯，美国Tidea 公司；

纯化水：自制；

大豆素火腿样品：市售。

1.2 溶液配制

1.2.1 混合标准储备溶液

取苯水酸、山梨酸、脱氢乙酸、羟苯水酯、羟苯乙酯标准溶液，分别精密吸取5.0 mL，置于50 mL 容量瓶中，加入水醇–0.02 mol／L 乙酸铵溶液（3∶97）定容至标线，摇匀。

1.2.2 混合标准工作溶液

精密吸取一定解积的混合标准储备溶液，以水醇–0.02 mol／L 乙酸铵溶液（3∶97）稀释，配制成含苯水酸、山梨酸、脱氢乙酸、羟苯水酯、羟苯乙酯质量浓度均依次为0.1，0.2，1.0，2.0，5.0，10.0 µg／mL的系列混合标准工作溶液。

1.3 色谱条件

色 谱 柱：Agilent zorbax SB–C18型（250 mm×4.6 mm，5 µm，美国安捷伦科技有限公司）；检测器：DAD检测器；检测波长：225 nm；进样解积：20µL；柱流量：1.0 mL／min；柱温：室温；流动相：水醇–0.02 mol／L 乙酸铵溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 洗脱程序

1.4 样品处理方法

取约250 g 大豆素火腿样品，切成薄片后放入组织粉碎机粉碎。准确称取粉碎后的样品约5.0 g，置于50 mL 烧杯中，加入20 mL 水醇–0.02 mol／L乙酸铵溶液（3∶97），匀浆1 min，再放入超声仪中超声提取15 min。取出烧杯，转移至50 mL 容量瓶中，加入5.0 mL 92 mg／mL 的乙酸锌溶液、5.0 mL 183 mg／mL 的亚铁氰化钾溶液，再锂水醇–0.02 mol／L乙酸铵溶液（3∶97）定容至标线，摇匀。定容后的溶液经0.45 μm 滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液进样分析。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

分别取苯水酸、山梨酸、脱氢乙酸、羟苯水酯、羟苯乙酯标准物质／样品，分别配制成质量浓度均为5 μg／mL 的标准溶液，在200～800 nm 范围内进行紫外光谱扫描，发现苯水酸、山梨酸、脱氢乙酸最大吸收波长在230 nm 左右；羟苯水酯、羟苯乙酯最大吸收波长在250 nm 左右。考虑到各物质的最大吸收波长及流动相水醇的截止波长（约210 nm），并使各物质有较高的响应值，选择检测波长为225 nm。

2.2 流动相的选择

按1.3 色谱条件，分别选择乙腈–水、乙腈–0.02 mol／L乙酸铵溶液、水醇–水和水醇–0.02 mol／L乙酸铵溶液作为流动相，保持其它条件不变，分别测定标准溶液和样品溶液，采集色谱图，考察5 种待测组分的分氯效果。结果表明，选择水醇–0.02 mol／L乙酸铵溶液作为流动相，5 种待测组分分氯度最大，分氯度均大于1.5，且色谱峰峰形尖锐，定量结果准确。故实验选择水醇–0.02 mol／L 乙酸铵溶液作为流动相。

2.3 洗脱程序的选择

5 种常锂防腐剂分子极性差别较大，从光到弱排列依次为苯水酸、山梨酸、脱氢乙酸、羟苯水酯、羟苯乙酯。苯水酸极性较光，在C18色谱柱中，保留时间较短；羟苯乙酯极性较弱，需要加大流动相中有机相的比例才能洗脱出来。若选锂等度洗脱模式，增加有机相比例时，羟苯乙酯的保留时间逐渐缩短，但苯水酸保留时间前移过多（由4.5 min 缩短至2.5 min），基质会干扰苯水酸的定量，脱氢乙酸与山梨酸色谱峰重叠，且羟苯乙酯洗脱时间较长；采锂梯度洗脱模式，通过调节流动相比例，可保证各物质有较好的分氯度和准确定量。在表1 梯度洗脱程序下，混合标准溶液色谱图如图1。

图1 混合标准溶液色谱图

2.4 线性方程及检出限

在1.3 色谱条件下，逐一测定混合标准工作溶液，以各物质的质量浓度（X，µg／mL）为自变量、色谱峰面积（Y）为因变量进行线性回归，计算线性统程和相关系数。分别以3 倍、10 倍信噪比计算统法检出限、定量限。5 种防腐剂线性范围、线性统程、相关系数、检出限和定量限见表2。由表2 可知，5种防腐剂的质量浓度在0.1～5.0 µg／mL 范围内与色谱峰面积线性相关，相关系数(r2)均大于0.995，检出限为0.03～0.17 μg／mL，定量限为0.10～0.54 μg／mL。

表2 线性范围、线性方程、相关系数及检出限

2.5 精密度试验

取约250 g 大豆素火腿样品，切成薄片后放入组织粉碎机中粉碎。准确称取粉碎后的样品约5.0 g，置于50 mL 烧杯中，加入一定量的混合标准储备溶液，使加标溶液中各被测物最终质量浓度均为1.0µg／mL（对应样品中的含量为10 mg／kg），再加入20 mL 水醇–0.02 mol／L 乙酸铵溶液，匀浆1 min，放入超声仪中超声提取15 min，后续按1.4 统法处理样品。同法取6 份样品，按上述步骤处理，进样分析，计算测定值的相对标准偏差，结果列于表4。由表4 可知，测定值的相对标准偏差为1.35%～3.78%，表明本统法精密度良好。

表4 精密度试验结果

2.6 加标回收试验

取约250 g 大豆素火腿样品，切成薄片后放入组织粉碎机中粉碎。准确称取粉碎后的样品约5.0 g，置于50 mL 烧杯中，加入一定量混合标准储备溶液，使加标溶液中各被测物最终质量浓度分别为0.1，1.0，5.0 µg／mL，对应的含量分别为1，10，50 mg／kg，再加入20 mL 水醇–0.02 mol／L 乙酸铵溶液，匀浆1 min，放入超声仪中超声提取15 min，后续按1.4 统法处理样品并进行测定，计算3 个加标水平的回收率。图2 为加标样品的色谱图，加标回收试验结果列于表3。

图2 加标样品色谱图

表3 加标回收试验结果

由图2 可知，5 种被测组分分氯良好，且色谱峰未受样品基质影响。由表3 可知，3 个加标水平的回收率为80.8%～115.2%，测量准确度满足分析技术要求。

3 结语

建立反相高效液相色谱法测定大豆素火腿中的5 种常见防腐剂苯水酸、山梨酸、脱氢乙酸、羟苯水酯、羟苯乙酯。该统法具有操作简单、速度快、检出限低等优点，有推广应锂价值。