酵母破壁程度测定方法的研究

周小辉， 陈毛清， 曹诗国， 梁大炜，戴晋军，， 徐智鹏，， 胡骏鹏，

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003；2.安琪酵母（崇左）有限公司，广西崇左545200）

酵母作为单细胞蛋白原料，应用于饲料和动物养殖行业已有近半个世纪的历史。 研究表明，将酵母直接干燥成酵母粉使用， 由于未经破壁处理，养殖动物对酵母的营养成分利用率较低 （徐那等，2015；杨翠竹等，2006；关苑等，1992）。 将酵母的细胞壁进行破碎处理， 使其释放出胞内的营养物质，可以提高利用率（尹敬博等，2018；郭小云等，2015；贺淼等，2014）。 酵母破壁常用的方法有两种：自溶法是利用酵母在自身水解酶类（蛋白酶、核酸酶、糖水解酶等）的作用下发生细胞壁裂解而释放出内容物（徐那等，2015）；外源酶法是通过控制一定的温度和pH， 在酶的作用下将酵母细胞壁破碎并使之释放出内容物（崔春等，2017；梁天姣等，2015）。

随着酵母产业和加工技术的发展， 饲料工业中应用的酵母蛋白原料越来越多， 然而目前研究中多为对酵母蛋白原料的应用评估， 而对酵母蛋白原料如何鉴别鲜有报道。 本实验通过革兰氏染色、酸溶蛋白质检测、氨基酸态氮检测3 种方法判定酵母破壁程度， 旨在为用户区分不同酵母蛋白原料的生理特性提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 酵母粉（编号分别为Y1、Y2、Y3）、自溶酵母（编号分别为A1、A2、A3）、外源酶解酵母（编号分别为E1、E2、E3）均由湖北省酵母功能重点实验室提供， 制备方法如下：（1）酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiaeHansen Z2.2，CCTCC NO： M205128）经液态纯培养发酵获得酵母乳；（2）酵母乳经离心、洗涤、喷雾干燥，制备获得酵母粉；（3） 将酵母乳在温度80 ℃进行热击50 s， 向上述酵母乳中加入5‰柠檬酸调节pH 至4.5；降温至50 ℃，保温12 h 后，经离心、洗涤、喷雾干燥，制备获得自溶酵母；（4）将酵母乳在温度80 ℃进行热击50 s，调节pH 为5.0，温度58 ℃，加入1‰木瓜蛋白酶进行酶解反应8 h， 升温到85 ℃保温5 h 灭酶，经离心、洗涤、喷雾干燥，制备获得外源酶解酵母。

实验试剂：革兰氏染色液试剂盒；三氯乙酸溶液，150 g/L； 凯氏定氮法实验试剂 （消化片；硫酸，密度为1.8419 g/L；硼酸溶液，20 g/L；氢氧化钠溶液，400 g/L； 滴定液，0.05 mol/L 硫酸溶液；混合指示液，1 份1 g/L 甲基红乙醇溶液与5 份1 g/L 溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合）；氨基酸态氮测定试剂（NaOH 标准滴定溶液，0.05 mol/L；甲醛溶液，36%）。

1.2 仪器与设备 光学显微镜， 江南XS212 型；凯氏定氮装置；酸度计，直接读数，测量范围（0 ～14），pH 精度±0.02；电磁搅拌器；碱式滴定管。

1.3 实验方法

1.3.1 光镜显微观察 采用革兰氏染色法（适当改进）对酵母是否破壁进行鉴别，其作用原理为：样品通过结晶紫初染和碘液媒染后，在酵母细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，乙醇脱色会使酵母细胞壁收缩，没有破壁的酵母细胞因为细胞壁收缩而将结晶紫与碘的复合物留在酵母细胞内，而破壁的酵母细胞则无法阻止结晶紫与碘的复合物被乙醇溶解后从破壁孔中洗脱下来。导致未破壁的酵母细胞呈复合物的紫色，而破壁酵母细胞则为无色。 具体操作如下：（1）配置0.5%样品溶液：分别取上述酵母粉 （Y1、Y2、Y3）， 自溶酵母（A1、A2、A3），外源酶解酵母（E1、E2、E3）样品各0.5 g（精确至0.01 g），加入到不同的洁净三角烧瓶中，每个烧瓶内加入100 mL 的纯净水， 使样品充分溶解。（2）涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10 μL 待检样品滴在载玻片的中央，用取液后的枪头将液滴涂布成一均匀的薄层（直径约1 cm的圆），涂布面不宜过大。 （3）干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。 （4）固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2 ～3 次，共2 ～3 s，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60 ℃），放置待冷后，进行染色。（5）初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1 ～2 滴，使染色液覆盖涂片，染色约1 min。 （6）水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 （7） 媒染： 用100 ～1000 μL 移液枪吸取约300 μL 碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1 min。（8）水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗， 直至洗下的水呈无色为止。（9）脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20 ～30 s，随即水洗。 （10）干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待各样品标本片干后置显微镜下（×40）观察。

1.3.2 粗蛋白质含量测定 采用凯氏定氮法对各样品的粗蛋白质含量进行检测，每个样品重复3 次。

1.3.3 酸溶性蛋白质含量测定 酵母通过自溶或外源酶水解破壁后，细胞中的大分子蛋白质会变成小分子蛋白质、多肽、小肽和游离氨基酸。上述小分子的含氮物质会通过破壁孔释放到酵母细胞外，溶解在各类介质中，因此通过测定溶解在各类介质中的蛋白质含量可以评估酵母水解物破壁程度。可溶性蛋白质指标包括：水溶性蛋白质、酸溶性蛋白质和碱溶性蛋白质。 本实验采用酸溶性蛋白质检测法。 具体操作如下：分别称取酵母粉、自溶酵母、外源酶解酵母样品1.00 g（精确至0.001 g），加入到不同的50 mL 洁净容量瓶中，然后向每个容量瓶中加入15%三氯乙酸溶液，振荡使样品溶解，定容。参照“GB/T 22492 附录B”中“酸溶蛋白质含量的测定”方法完成后续操作及检测。

1.3.4 氨基酸态氮含量测定 饲料行业检测可溶性氮含量的方法主要有：氨基酸态氮检测法和游离氨基酸检测法。前者采用化学滴定的方法检测样品中以游离的氨基形式存在的氮含量，后者采用高效液相色谱法（HPLC）检测样品中的游离氨基酸含量。 本实验采用氨基酸态氮检测法，按现行国家标准GB 5009.235 第一法执行。具体操作如下：分别称取酵母粉（Y1、Y2、Y3）、自溶酵母（A1、A2、A3）、外源酶解酵母（E1、E2、E3）样品各5.0 g（精确至0.01 g），加入到不同的50 mL 洁净烧杯中，用纯水分数次洗涤至100 mL 容量瓶中，振荡使样品充分溶解，定容。 参照“GB 5009.235第一法酸度计法” 完成后续操作及检测，每个样品重复3 次。

1.4 数据处理与统计分析 试验数据采用Excel进行预处理，以“平均数±标准差”表示，采用SPSS 18.0 统计软件中one-way ANOVA 进行单因素方差分析，差异显著性用Duncan 氏多重比较法，以P ＜0.05 作为差异显著性的判断标准。

2 结果与分析

2.1 光镜显微观察 酵母粉、自溶酵母、外源酶解酵母样品的革兰氏染色法检测结果显示 （图1～图3）：未破壁的酵母粉、通过自溶破壁的自溶酵母、 通过外源酶催化水解破壁的外源酶解酵母的颜色存在明显差异，酵母粉（Y1-Y3）样品均显示为结晶紫与碘复合物的紫色； 自溶酵母 （A1-A3）均显示部分酵母为紫色、部分酵母为无色；外源酶解酵母（E1-E3）都是无色，只有极个别酵母为紫色。光镜显微观察结果表明，革兰氏染色法检测可以区分酵母是否破壁， 但该方法无法对酵母的破壁程度做定量分析， 需要结合理化指标检测结果进一步判定。

2.2 粗蛋白质、酸溶性蛋白质、氨基酸态氮含量由表1 可知， 相同菌种和发酵工艺制备的酵母粉、自溶酵母、外源酶解酵母的粗蛋白质含量无显著差异（P ＞0.05）；外源酶解酵母的酸溶蛋白质、氨基酸态氮含量均显著高于自溶酵母和酵母粉（P ＜0.05）；自溶酵母的酸溶蛋白质、氨基酸态氮含量显著高于酵母粉（P ＜0.05）。 本实验结果表明， 自溶法和外源酶解法有助于酵母破壁，酸溶蛋白质和氨基酸态氮可以评估酵母破壁后理化指标的变化。

表1 不同样品的粗蛋白质、可溶性蛋白质、可溶性氮含量%

3 讨论

酵母细胞中富含蛋白质、 核酸、B 族维生素、酵母细胞壁多糖及其他生理活性物质， 这些有效成分主要存在于酵母细胞内或者是酵母细胞结构中。 许乐乐等（2015）通过光学显微镜对活性干酵母和啤酒酵母粉的细胞形态进行了观察， 指出活酵母和死的啤酒酵母粉在细胞饱满度和光泽度上有明显区别； 其借鉴改良后的革兰氏染色法观察酵母水解物、啤酒酵母粉和活性干酵母，发现酵母的不同组织呈现出不同的颜色， 可用于区别酵母水解物与酵母细胞壁， 但不能将酵母是否破壁进行明显的区分。 本实验通过将革兰氏染色法进行适当改进后， 可以明显区别未破壁的酵母粉和已破壁的外源酶解酵母， 但不能判断自溶酵母的破壁程度。

姚晓红等（2007） 对酵母自溶条件的研究表明， 自溶破壁可以使酵母释放出游离氨基酸和可溶性蛋白； 而采用添加不同的外源酶对酵母破壁的研究表明， 相比于自溶破壁可以获得更高的游离氨基酸、氨基酸态氮和可溶性蛋白质含量（崔春等，2017；罗龙娟等，2014；许维娜等，2013）。 徐耀文等（2013）通过外源酶将酵母破壁得到呈味核苷酸，郭莎莎（2012）通过酶解酵母细胞得到生物活性肽， 酶解破壁使酵母可以得到更多的营养物质和活性物质。本研究结果也表明，通过添加外源酶进行酵母细胞破壁的方式优于自溶破壁。

酵母自溶或外源酶解破壁会使样品中游离氨基酸、氨基酸态氮、可溶性蛋白、酸溶性蛋白含量等升高（苏星等，2019；徐那等，2015）。从本实验结果“酸溶蛋白质/粗蛋白质”指标可以发现，外源酶解酵母的酸溶蛋白质含量接近粗蛋白质的含量，说明添加外源酶催化水解的方式能够使酵母细胞破壁酶解更充分，获得更多的肽和游离氨基酸（按照“GB/T 22492”附录B 定义，酸溶蛋白含量为样品中小分子的肽和游离氨基酸的总和）。近来的动物应用研究也表明， 酵母自溶或酶解后得到的肽是对动物非常重要的营养成分（蔡大亮等，2017；袁明凤等，2016；杨凡等，2016；贺淼等，2013）。

4 结论

采用革兰氏染色法可以明显区分酵母是否破壁， 通过检测酸溶蛋白质含量和氨基酸态氮含量可以评估酵母产品的破壁程度，可作为饲料行业对破壁酵母类产品进行品控的评判依据。