β3Gn-T8对胃癌AGS细胞增殖能力的影响*

刘振华，沈 力，吴士良△

(1苏州卫生职业技术学院病理教研室， 江苏 苏州 215009； 2苏州大学医学部生物化学与分子生物学教研室， 江苏 苏州 215123)

胃癌是常见的消化道系统恶性肿瘤，发病率和病死率率较高。人β1,3-N-乙酰葡萄糖胺转移酶8(β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 8，β3Gn-T8)是利用TBLASTN信息途径，以信息探针β3GalT1在NCBI的EST数据库进行同源筛选，从人肺cDNA文库中克隆到的一种新的糖基转移酶基因[1],该基因在结肠癌和肝癌高表达而且能够促进结肠癌和肝癌侵袭转移[2-3]，但关于该基因对胃癌生物学行为影响的研究较少。本研究探讨β3Gn-T8对胃癌AGS细胞增殖的影响，为寻找胃癌的生物治疗靶标提供线索。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃腺癌细胞株AGS由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。β3Gn-T8表达载体pEGFP-C1-β3Gn-T8由本实验室构建并保存。抗β3Gn-T8多克隆抗体由本实验室制备。引物设计采用Genetyx软件，并经GenBank BLAST同源检索后由上海英骏公司合成。β3Gn-T8的正向引物序列为5′-CCCTGACTTCGCCTCCTAC-3′，反向引物序列为5′-GGTCTTTGAGCGTC-TGGTTGA-3′;内参照β-actin的正向引物序列为5′-CCTCTATGCCAACCACAGTGC-3′，反向引物序列为5′-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3′。10只SPF雌性 BALB/c裸小鼠[许可证号为SCXK(苏)2007-0005)]购自苏州大学实验动物中心。annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自Invirogen；MTT和DMSO购自Sigma。

2 方法

2.1细胞培养 人胃癌细胞株AGS培养于含10%灭活胎牛血清的Ham’s F12培养基中，置37 ℃、 5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。每3 d传代1次。细胞贴壁生长，至70%～80%融合时，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA液消化传代。

2.2pEGFP-C1和 pEGFP-C1-β3Gn-T8转染AGS细胞 在转染实验前天将细胞接种于6孔培养皿(35 mm)，转染当天，更换1 mL新鲜的无血清培养基，逐滴加入100 μL脂质体/DNA混合物于6孔培养板内，边加边轻摇培养板。37 ℃孵育6 h，6 h后更换转染培养基，加入2 mL含10%小牛血清的新鲜生长培养基。

2.3RT-PCR检测β3Gn-T8的mRNA表达 转染β3Gn-T8 表达载体后，分别在24 h、48 h和72 h收集细胞。总RNA提取采用TRIzol一步法。RT操作如下：加入RNA模板4 μL、随机引物2 μL、0.1%DEPC水9 μL，在70 ℃反应5 min后，迅速降至4 ℃，再加入5×MMLV缓冲液8 μL、25 mmol/L dNTP 1 μL、RNAsin 0.5 μL、MMLV 1 μL、0.1% DEPC水14.5 μL，经过37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min反应后，迅速降至4 ℃。以所获cDNA为模板，进行PCR扩增，体系如下：10×buffer 2.5 μL、MgCl21.5 μL、 dNTP 1 μL、GAPDH上下游引物各 1 μL、RT生成的cDNA 1 μL、Taq酶0.5 μL、加ddH2O补至反应体积25 μL。94 ℃ 5 min预变性；94 ℃变性30 s、55 ℃退火45 s 、72 ℃延伸75 s，循环25次，72 ℃后延伸7 min，4 ℃保存。取PCR产物10 μL和上样缓冲液2 μL混合上样，与DL2000 DNA marker一起在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离后，溴乙啶染色10 min，图像分析仪(UVP)拍照并分析结果。图像分析使用BandScan 4.0软件，分析目的条带总灰度，并使用内参照校准。

2.4Western blot法检测蛋白的表达 蛋白样品制备及定量后， SDS-PAGE分离，时间3 h～4 h，起始电压80 V，样品进入分离胶后转为130 V，电泳至溴酚兰刚跑出即终止。剥胶进行转膜，将转好的PVDF膜有蛋白的一面标记，1×丽春红染液染色5 min～10 min，封闭液室温下封闭1 h，将 I 抗用含0.05% Tween-20 的TBS稀释至适当浓度，室温下孵育1 h～2 h。同上法准备 II 抗稀释液，室温下孵育1 h～2 h后用TBST洗膜6次，每次5 min。化学发光、显影、定影，将胶片进行透射扫描，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。使用BandScan 4.0分析条带总灰度，并使用内参照校准。

2.5MTT法测定细胞活力 将细胞分为3个实验组:未处理对照(control)组、pEGFP-C1组和pEGFP-C1-β3Gn-T8组。将每组细胞接种于96孔板，消化细胞并调整细胞数，使每孔细胞数为4 000个，每组设4个复孔。分别于细胞处理24 h、48 h、72 h和96 h弃去上清，加入培养基180 μL，每孔再加入MTT 20 μL，继续培养4 h后，吸出培养液，加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min。在酶联免疫检测仪上于570 nm 波长处读取标本的吸光度(A)值，各组的吸光度与对照组的吸光度比值为细胞活力。

2.6台盼蓝染色活细胞计数 将处于对数生长期的未转染组、pEGFP-C1组和 pEGFP-C1-β3Gn-T8组AGS细胞以每孔1×105个接种于 6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱过夜，24 h后，用胰酶消化细胞，采用台盼蓝染色，进行活细胞计数。

2.7流式细胞术检测细胞凋亡 将各组细胞接种于96孔板，消化细胞并调整细胞数，使每孔细胞数为4 000个，每组设4个复孔；细胞处理48 h后，调整待测细胞的浓度为5×108～1×109个/L；取1 mL细胞，1 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清；加入1 mL冷PBS，轻轻振荡使细胞悬浮，1 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清；将细胞重悬于200 μL binding buffer；加入10 μL annexin V-FITC和10 μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min；加入300 μL binding buffer，立即上机检测。

2.8裸鼠饲养及体内成瘤实验检测 4周～5周龄，体重20～24 g的雌性BALB/c裸小鼠10只于无特定病原体(SPF)环境饲养。将动物随机分2组，每组5只。分别接种细胞悬液，对照组为未处理AGS细胞；实验组为转染pEGFP-C1-β3Gn-T8的AGS细胞。用碘伏消毒受种裸鼠右侧颈部，用1 mL注射器吸取0.2 mL细胞悬液(含有细胞数>2×106个)接种于皮下，观察瘤块成形。每4 d 游标卡尺测量肿瘤体积1 次，28 d 颈椎脱位处死裸鼠，完整剥离瘤体，计算体积，瘤体积=1/2ab2(a为长径，b为短径)。

3 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件包进行数据统计分析，正态分布计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 转染正义载体后β3Gn-T8的mRNA表达变化

转染β3Gn-T8 正义载体pEGFP-C1-β3Gn-T8后，在24 h、48 h和72 h分别检测β3Gn-T8的mRNA表达水平。在24 h开始出现β3Gn-T8的mRNA表达的升高，在48 h和72 h仍持续高表达。与对照组比较，在24 h、48 h和72 h点，β3Gn-T8的 mRNA表达显著升高(P<0.01)，见图1。

Figure 1. The mRNA expression of β3Gn-T8 in the AGS cells after transfection with pEGFP-C1-β3Gn-T8. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
图1 转染pEGFP-C1-β3Gn-T8后AGS细胞β3Gn-T8的mRNA表达变化

2 转染正义载体后β3Gn-T8蛋白表达的变化

转染β3Gn-T8 正义载体后，在48 h和72 h，β3Gn-T8蛋白的表达较对照组显著升高(P<0.01)，见图2。

Figure 2. The protein expression of β3Gn-T8 in the AGS cells after transfection with pEGFP-C1-β3Gn-T8. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
图2 转染pEGFP-C1-β3Gn-T8后AGS细胞β3Gn-T8蛋白表达的变化

3 β3Gn-T8对AGS细胞增殖的影响

与对照组相比，转染pEGFP-C1-β3Gn-T8后，24 h、48 h、72 h和96 h AGS细胞的活力明显增加(P<0.05或P<0.01)。各时点的细胞数以相对A值(相对于16 h的比值)绘制生长曲线，见图3。

Figure 3. MTT assay was used to detect the changes in cell viability at different time points (24 h, 48 h, 72 h and 96 h). Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.
图3 采用MTT实验在不同时点检测细胞活力的变化

用台盼蓝染色计算活细胞数目的实验中，与对照组比较，转染pEGFP-C1-β3Gn-T8组存活细胞数量增多(P<0.05)，见图4。

Figure 4. The viable cells counted by the method of trypan blue exclusion. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.
图4 台盼蓝活细胞计数

4 流式细胞术检测细胞凋亡

与对照组相比，pEGFP-C1-β3GnT8组细胞的凋亡率无明显变化，见图5。

Figure 5. Flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of AGS cells. Mean±SD.n=3.
图5 流式细胞术检测AGS细胞凋亡率

5 移植瘤成瘤时间、体积和重量的变化

对照组在接种后4～5 d 出现肉眼可见的瘤体；pEGFP-c1-β3Gn-T8组在接种瘤细胞后3～4 d长出肉眼可见的瘤体。实验终止后，对移植瘤的最终体积和最终重量进行比较，pEGFP-C1-β3Gn-T8组的体积和重量均大于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 裸鼠成瘤情况Table 1. Tumor formation in nude mice (Mean±SD. n=5)

*P<0.05vscontrol group.

6 移植瘤生长曲线

以各组移植瘤的体积均值为纵座标，观察天数为横座标，绘制生长曲线图。比较各组曲线斜率的差异，结果显示pEGFP-C1-β3Gn-T8组生长曲线斜率明显大于对照组(P<0.05)，提示pEGFP-C1β3Gn-T8组肿瘤的生长速度较对照组快，见图6。

Figure 6. Growth curve of transplanted tumor. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.
图6 移植瘤生长曲线

讨 论

糖基转移酶可以直接改变细胞表面糖基化复合体受体和细胞黏附分子的糖链，从而促进或抑制肿瘤细胞的生长。前期研究发现，β3Gn-T8可促进喉癌Hep-2细胞[4]、白血病HL-60细胞[5]和胶质瘤细胞[6]的增殖。胃癌组织中β3Gn-T8表达增加[7]，与胃癌侵袭能力相关。本文通过上调该基因的表达研究了其对胃癌细胞的增殖及裸鼠移植瘤的形成的影响。

pEGFP-C1是一种具有荧光蛋白的真核表达载体，能够稳定高表达哺乳动物细胞中插入的外源片段。脂质体是一种应用广泛的非病毒载体，是由双层结构组成的封闭囊泡，具有良好的生物相容性。它通过内吞作用将DNA引入细胞。转染率高，重复性好，包装容量大，能保护DNA不被核酸酶降解。本研究通过脂质体转染质粒DNA，在mRNA和蛋白水平成功上调AGS细胞β3Gn-T8的表达。

增殖异常是肿瘤细胞的重要特征之一。MTT比色法检测AGS细胞的活力，pEGFP-C1-β3Gn-T8组明显高于对照组，活细胞计数显示pEGFP-C1-β3Gn-T8组显著高于对照组，以上实验结果均提示β3Gn-T8能促进AGS细胞增殖。有报道干扰β3Gn-T8的表达导致白血病细胞K562细胞周期在G1/S期停滞[8]。用流式细胞术检测凋亡的结果显示，转染pEGFP-C1-β3Gn-T8组与对照组的细胞凋亡率的差异无统计学显著性，说明胃癌细胞的加速生长不是由于细胞凋亡的增加，而是生长速率的增加。

裸鼠致瘤性是检测细胞恶性特性的方法之一[9]。将pEGFP-C1-β3Gn-T8和对照组2组胃癌细胞接种于裸鼠皮肤下，成瘤率为100%，pEGFP-C1-β3Gn-T8组成瘤时间明显短于对照组，移植瘤最终体积和重量均显著大于对照组。比较各组的生长曲线，pEGFP-C1-β3Gn-T8组的斜率明显高于对照组。上述结果表明，上调β3Gn-T8可以促进移植瘤的生长。

有研究报道[10]，胃癌组织β3Gn-T8表达增加，且与胃癌的增殖、侵袭和转移等生物学特性有关。β3Gn-T8在肝癌的表达增加，且通过改变CD-147蛋白表面的糖链结构，影响肝癌的侵袭转移[3]。垂体肿瘤β3Gn-T8表达增加，且与恶性度正相关[11]。在130例白血病骨髓样本中，β3Gn-T8和催化产物多聚乳糖胺链表达增加[12]。上述结果与本文结果相似，提示β3Gn-T8对肿瘤的恶性生物学行为有重要影响，是潜在的治疗靶点。

综上所述，β3Gn-T8对胃癌AGS细胞的生长有促进作用，促进胃癌AGS细胞的裸鼠移植瘤的成瘤作用。