盐酸普鲁卡因诱导下海洋真菌Hypocrea lixii次级代谢化学成分

杨文聪，刘亚月，杨静明，黎钊坪，梁金月，聂影影，马小翔，张 翼

（1.广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518120；2.广东海洋大学食品科技学院// 广东省水产品加工与安全重点实验室// 广东省海洋生物制品工程实验室// 广东省海洋食品工程技术研究中心// 水产品深加工广东普通高等学校重点实验室// 广东海洋大学海洋药物研究所，广东 湛江 524088）

海洋真菌所产生的结构多样的次级代谢物是药物发现的重要来源之一[1-2]。它们通常具有抗肿瘤、抗HIV、抗真菌、抗细菌、抗AChE 和抗氧化等生物活性，作为药物先导化合物日益受到研究者的关注[3-6]。然而，这些化合物只是真菌次生代谢潜力的“冰山一角”，为了充分挖掘菌株潜力，表观遗传修饰、等离子体诱变、基因组挖掘和共培养等各种方法被用于激活微生物天然产物沉默生物合成途径[7-10]。表观遗传修饰方法主要通过抑制DNA 甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶，因其具有较好的实用性，是一种越来越受重视的化学诱导手段[11-12]。

黑甲肉座菌Hypocrea lixii（哈茨木霉Trichoderma harzianum的有性型），为广泛存在于植物的内生真菌，也是重要的生物防治用途的菌株。对该真菌的次级代谢产物的研究相对较少，值得深入研究[13]。本实验室从大连海滨的海绵中分离得到一株真菌H.lixiiDLEN2008010，前期研究发现该菌株代谢产物具有DPPH 自由基清除活性及AChE抑制活性[14]。另外，文献报导H.lixii这个种的菌株能产生异黄酮类化合物[15]，该类化合物通常显示出较好的抗肿瘤、抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制活性[16-18]。然而，关于H.lixii次级代谢产物研究中未见使用表观遗传修饰诱导次级代谢产物多样性的报道。为了深入挖掘H.lixiiDLEN2008010 的代谢潜力，并发现抗老年痴呆相关活性的代谢产物，本研究使用了一种DNA 甲基转移酶抑制剂盐酸普鲁卡因刺激该真菌，分析其对菌株次级代谢的影响，从其固体发酵产物中分离异黄酮类化合物，并对其抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器与试剂 Advance 500 MHz 核磁共振波谱仪，maXis Q-TOF 高分辨质谱仪（德国Bruker公司）；1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Epoch2 酶标仪（美国BioTek 公司）；R-300 旋转蒸发仪（瑞士 BüChi 公司）；HPX-9082MBE 电热恒温培养箱，BSC-1300ⅡA2生物安全柜（上海博讯实业有限公司）；IRM-100全自动高压灭菌锅（德国爱安姆公司）；HP Plus 50D超高压液相色谱仪（苏州利穗有限公司）；ME204E型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

电鳗乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE），C3389；碘代硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholine iodide，ATCI），DA0048；牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA），A1933；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH），D9132；海盐，S9883 均购自Sigma-Aldrich；5,5’-二硫代二硝基苯甲酸（Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB），D8130，购自Ruibio 公司；盐酸普鲁卡因，购自上海阿拉丁试剂公司；琼脂、蛋白胨均购自北京奥博星生物技术有限公司的生物纯试剂；其余试剂均为国产分析纯试剂；硅胶（0.15 mm～ 0.3 mm 和0.05 mm～ 0.075 mm）购自青岛海洋化工厂；Sephadex LH-20，购自瑞士GE-Healthcare Bio-sciences公司；ODS-AP 反相制备色谱柱（20 mm×250 mm，15 µm，大连依利特公司）。

1.1.2 实验菌株 海洋真菌Hypocrea lixiiDLEN2008010 分离自2008 年采集于中国辽宁省大连市付家庄海边的海绵，经ITS rDNA 全序列分析确定为黑甲肉座菌（Genbank 登录号：HQ149775），菌株保藏于广东海洋大学海洋药物研究所。

1.1.3 培养基配制 PDA 培养基：土豆汁500 mL（200 g 土豆熬至500 mL 土豆汁），蔗糖20 g，蛋白胨5 g，海盐20 g，加入纯水至1 L，121℃灭菌20 min（pH=7.2）。大豆培养基：往3 L 的锥形瓶加入500 g 大豆，500 mL 水，121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 规模培养、提取及分离 往30 个平放且含有大豆培养基的锥形瓶，各加入20 mL 生理盐水洗落的菌悬液，置于28℃培养2 d，待有新的菌体形成后，均匀加入20 mL 过滤除菌的盐酸普鲁卡因水溶液，使其最终浓度为10 mmol/L，继续培养30 d。规模培养结束后，重复三次往每个锥形瓶加入1 L甲醇，并超声30 min，过滤，减压浓缩滤液至3 L。

将上述粗提物用10 kg 的XAD-16 大孔树脂吸附，并转移至层析柱，通过加入纯水将多糖除去，洗至流出液接近无色透明，后分别加入一个柱体积的甲醇、丙酮解吸附，真空浓缩至干，得粗提物1.2kg。

粗提物在减压硅胶柱（0.15mm～ 0.3mm）依次经石油醚（Pe）/乙酸乙酯（EtOAc）（体积比为7∶3、1∶1、3∶7）、Pe、氯仿（Chl）/甲醇（MeOH）（体积比为10∶1、5∶1）和纯甲醇洗脱得Fr.1～Fr.7。Fr.5（5 g）在硅胶柱（0.05mm～ 0.075mm）经Chl、Chl/ MeOH（体积比为 200∶1、100∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1）各一个体积洗脱得到SFr.5-1～ SFr.5-10。SFr.5-4（0.25 g）经Sephadex LH-20 凝胶柱MeOH 洗脱得到组分SFr.5-4-1～ SFr.5-4-6。其中 SFr.5-4-4 经 pHPLC（ODS-AP，15 µm，20.0 mm × 250 mm）通过MeOH/H2O（体积比为1∶3）等度洗脱，在tR=16 min收集，得到化合物1（5 mg）。SFr.5-4-4 经pHPLC（色谱柱同上）通过MeOH/H2O（体积比为1∶3）等度洗脱，在tR=36 min收集得到化合物6（15 mg），在tR=48 min 收集得到化合物5（18 mg）。SFr.5-4-6经pHPLC（色谱柱同上）通过MeOH/H2O（体积比为2∶3）等度洗脱，在tR=17 min 收集得到化合物2（8 mg）。SFr.5-6（0.62 g）经Sephadex LH-20 凝胶柱MeOH 洗脱得到组分SFr.5-6-1～ SFr.5-6-6，从SFr.5-6-6 中使用硅胶制备薄层层析[展开剂为Chl/MeOH（体积比为10∶1）]得到化合物7（5 mg）。SFr.5-8（0.19 g）经pHPLC（色谱柱同上）通过MeOH/H2O（体积比为3∶7）等度洗脱，在tR=26 min 收集得到化合物4（5 mg）。Fr.4（4.3 g）在硅胶柱（0.05mm～0.075mm）经Pe/EtOAc（体积比为1∶1）洗脱至纯乙酸乙酯，分别得到SFr.4-1～ SFr.4-9。其中SFr.4-4（0.73 g）经ODS 反相层析柱通过MeOH/H2O（体积比为2∶3）等度洗脱，得到化合物3（100 mg）。

1.2.2 HPLC 指纹图谱分析 通过Agilent Infinity II 1260 分析在大豆培养基提取物及不同条件下Hypocrea lixii发酵提取物的HPLC 指纹图谱。洗脱梯度如下：0～35 min，从体积分数为10%甲醇-H2O线性洗至100%甲醇；35～40 min，100%甲醇；40～42 min，纯甲醇线性洗至体积分数为10%甲醇-H2O；42～ 45 min，体积分数为10%甲醇-H2O。进样量10 μL，流速为1 mL/min，检测波长为254 nm。

1.2.3 AChE 抑制活性测定 通过优化的Ellman 比色法[19]在96 孔板中测定化合物对AChE 体外抑制活性。将化合物溶解于DMSO 并配成10 mmol/L 且进行倍半梯度稀释，往96 孔板中每孔加1 μL 不同浓度样品，再依次加入49μL PBS、10μL 0.2 U/mL AChE 和20 μL DTNB，将96 孔板置于37℃培养箱保温10 min。然后往每个孔加入20 μL ATCI，继续于37℃培养箱孵育。20 min 后，通过酶标仪测定λ405处的吸光值，并通过下述公式计算化合物对AChE的抑制率，其中Asampleblank为加入样品和BSA 而不加入AChE 的吸光度，Asample为加入样品和AChE的吸光度，Acontrol为加入AChE 而不加入样品的吸光度，Ablank为加入BSA 而不加入样品和AChE 的吸光度。盐酸化多奈哌齐作为阳性对照。

IC50值是化合物对AChE 抑制率为50%所对应的浓度。将抑制率和浓度对数（lnC）导入Origin 8.0软件。通过三次多项式回归方程拟合得到浓度对数曲线，并计算得到ln（IC50）。最后使用Microsoft Excel 计算得到IC50。

1.2.4 DPPH 自由基清除活性测定 使用Sharma和Bhat 描述的DPPH 自由基清除法[20]，在96 孔板中测定化合物的抗氧化能力。总反应体系为100μL，Asample为含有50μL 的0.16 mmol/L DPPH 和50μL溶解不同浓度化合物的DMSO。与此同时，50 μL 1.6 mmol/L DPPH 和50 μL DMSO 用作对照（Acontrol），50 μLMeOH 和50 μL 溶解不同浓度化合物的DMSO 作为样品本底（Asampleblank），50 μLMeOH 和50 μL DMSO 作为空白（Ablank），将96 孔板放置在暗处30 min。通过酶标仪测定λ517处的吸光度。维生素C 作为阳性对照。

EC50值是化合物对DPPH 自由基清除率为50%所对应的浓度。将清除率和浓度对数（lnC）导入Origin 8.0 软件。通过三次多项式回归方程拟合得到浓度对数曲线，并计算得到ln（EC50）。最后使用Microsoft Excel 计算得到EC50。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

本研究从该菌株化学诱导发酵产物中共分离到以下7 种化合物（图1）。

图1 化合物1～7 的结构Fig.1 The structures of compounds 1～7

2.1.1 化合物1 化合物1 为浅黄色非晶型固体，在氯仿/甲醇（体积比为25∶1）的60 F254TLC 的Rf值为0.56，硫酸-茴香醛显色为黄色。该化合物易溶于丙酮。HR-ESI-MS，m/z 计算值：499.1250（C25H23O11-，[M-H]-）；实测值：499.1240，确定分子式为C25H24O11，不饱和度为14；1H NMR 在δH3.45（1H，t，H-4’’），3.54（1H，m，H-2’’），3.59（1H，m，H-3’’），3.90（1H，m，H-5’’）和5.17（1H，d，J=7.5，H-1’’）提示分子中存在一个糖环的片段，在δH6.89（2H，dd，J=6.5，2.0 Hz，H-3’/5’）和7.44（2H，dd，J=7.0，2.0 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一个对位取代的苯环。核磁波谱数据如下。

1H NMR（500 MHz，Acetone-d6）：δH1.87（3H，dd，J=6.9，1.7 Hz，H-4’’’），3.45（1H，t，H-4’’），3.54（1H，m，H-2’’），3.59（1H，m，H-3’’），3.90（1H，m，H-5’’），4.22（1H，dd，J=11.9，7.4 Hz，Ha-6’’），4.54（1H，dd，J=12.0，2.1 Hz，Hb-6’’），5.17（1H，d，J=7.5，H-1’’），5.90（1H，dd，J=15.6，1.7 Hz，H-2’’’），6.47（1H，d，J=2.2 Hz，H-6），6.66（1H，d，J=2.2 Hz，H-8），6.89（2H，dd，J=8.7，2.0 Hz，H-3’/5’），6.97（1H，dq，J=15.5，6.7 Hz，H-3’’’），7.44（2H，dd，J=8.7，2.0 Hz，H-2’/6’），8.24（1H，s，H-2），8.60（1H，brs，4’-OH），13.00（1H，s，5-OH）。

13C NMR（125 MHz，Acetone-d6）：δC18.1（C-4’’’），64.1（C-6’’），71.3（C-4’’），74.5（C-2’’），75.2（C-5’’），77.8（C-3’’），95.5（C-8），100.6（C-6），101.2（C-1’’），107.6（C-10），116.0（C-3’/5’），122.8（C-3），123.2（C-2’’’），124.3（C-1’），131.2（C-2’/6’），145.8（C-3’’’），154.8（C-2），158.6（C-4’），163.5（C-5），164.3（C-7），166.4（C-1’’’），181.9（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR，且通过J1’’2’’＞7.0 Hz确定葡萄糖残基的β 构型，通过J2’’’3’’’＞15.0 Hz 确定侧链双键的反式构型，并与文献[21]比对，确定该化合物为6''-O-crotonylgenistin。

2.1.2 化合物2 化合物2 为白色非晶型固体，在氯仿/甲醇（体积比为10∶1）的60 F254TLC 的Rf值为0.51，硫酸-茴香醛显色为黄色。该化合物易溶于丙酮。1H NMR 在δH6.90（2H，d，J=8.6 Hz，H-3’/5’）和7.45（2H，d，J=8.6 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一个对位取代的苯环。核磁波谱数据如下。

1H NMR（500 MHz，Acetone-d6）：δH6.28（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），6.42（1H，d，J=2.1 Hz，H-8），6.90（2H，d，J=8.6 Hz，H-3’/5’），7.45（2H，d，J=8.6 Hz，H-2’/6’），8.15（1H，s，H-2），9.00（1H，brs，4’-OH），13.02（1H，s，5-OH）。

13C NMR（125 MHz，Acetone-d6）：δC94.5（C-8），99.9（C-6），106.1（C-10），116.0（C-3’/5’），123.1（C-1’），124.0（C-3），131.2（C-2’/6’），154.3（C-2），158.4（C-4’），159.1（C-9），163.9（C-5），165.3（C-7），181.6（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR 并与文献[22]比对，确定该化合物为genistein。

2.1.3 化合物3 化合物3 为浅黄色非晶型固体，在氯仿/甲醇（体积比为10∶1）的60 F254TLC 的Rf值为0.50，硫酸-茴香醛显色为浅紫色。该化合物易溶于DMSO。1H NMR 在δH6.80（1H，d，J=8.7 Hz，H-3’/5’）和7.37（2H，d，J=8.7 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一个对位取代的苯环。核磁波谱数据如下。

1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δH6.81（1H，d，J=2.3 Hz，H-8），6.80（2H，d，J=8.7 Hz，H-3’/5’），6.90（1H，dd，J=8.8，2.3 Hz，H-6），7.37（2H，d，J=8.7 Hz，H-2’/6’），7.94（1H，d，J=8.7 Hz，H-5），8.26（1H，s，H-2），9.60（1H，brs，4’-OH）。

13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δC102.0（C-8），114.9（C-3’/5’），115.5（C-6），116.2（C-10），122.6（C-3），123.4（C-1’），127.2（C-5），130.1（C-2’/6’），152.7（C-2），157.1（C-4’），157.5（C-9），163.4（C-7），174.6（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR 并与文献[23]比对，确定化合物为daidzein。

2.1.4 化合物4 化合物4 为浅黄色非晶型固体，在氯仿/甲醇（体积比为10∶1）的60 F254TLC 的Rf值为0.1，硫酸-茴香醛显色为无色。该化合物易溶于DMSO。1H NMR 在δH3.17（1H，t，J=9.0 Hz，H-4’’）、3.26（1H，m，H-2’’）、3.31（1H，m，H-3’’）、3.45（2H，m，H-5’’，H-6’’b）、3.71（1H，d，J=7.6 Hz，H-6’’a）和5.06（1H，d，J=7.6 Hz，H-1’’）提示分子中存在一个糖环的片段，δH6.83（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-3’/5’）和7.40（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-2’/6’）提示分子中存在一个对位取代的苯环。核磁波谱数据如下。

1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δH3.17（1H，t，J=9.0 Hz，H-4’’），3.26（1H，m，H-2’’），3.31（1H，m，H-3’’），3.45（2H，m，H-5’’，H-6’’b），3.71（1H，d，J=7.6 Hz，H-6’’a），5.06（1H，d，J=7.6 Hz，H-1’’），6.47（1H，d，J=2.2，H-6），6.72（1H，d，J=2.2 Hz，H-8），6.83（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-3’/5’），7.40（2H，dd，J=8.6，1.4 Hz，H-2’/6’），8.43（1H，s，H-2），9.74（1H，brs，7-OH），12.94（1H，brs，5-OH）。

13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δC60.6（C-6’’），69.6（C-4’’），73.1（C-2’’），76.4（C-3’’），77.2（C-5’’），94.5（C-8），99.6（C-6），99.9（C-1’’），106.1（C-10），115.1（C-3’,C-5’），121.0（C-1’），122.6（C-3），130.2（C-2’,C-6’），154.6（C-2），157.2（C-9），157.6（C-4’），161.6（C-5），163.0（C-7），180.5（C-4）。

分析1H NMR、13C NMR，且通过J1’’2’’＞7.0 Hz确定葡萄糖残基的β 构型，并与文献[24]比对，确定该化合物为genistin。

2.1.5 化合物5 化合物5 为黄色非晶型固体，在氯仿/甲醇（体积比为10∶1）的60 F254TLC 的Rf值为0.87，硫酸-茴香醛显色为柠檬黄。该化合物易溶于甲醇、丙酮。核磁波谱数据如下。

1H NMR（500 MHz，acetone-d6）：δH3.77（3H，s，H3-8），5.40（2H，brs，4-NH2），6.67（2H，dd，J=6.3，1.4 Hz，H-3/5），7.72（2H，dd，J=6.3，1.4 Hz，H-2/6）。

13C NMR（125 MHz，acetone-d6）：δC51.4（C-8），113.9（C-3,C-5），118.5（C-1），132.1（C-2,C-6），154.0（C-4），167.3（C-7）。

分析1H NMR、13C NMR 并与文献[25]比对，确定该化合物为对氨基苯甲酸甲酯。

2.1.6 化合物6 化合物6 为浅黄色针状结晶，在甲醇/水（体积比为2∶3）的C18TLC 的Rf值为0.43，硫酸-茴香醛显色为粉色。该化合物易溶于甲醇。核磁波谱数据如下。

1H NMR（500 MHz，CD3OD）：δH2.53（2H，t，J=7.7 Hz，H2-8），2.80（2H，t，J=7.7 Hz，H2-7），6.69（2H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-3/5），7.03（2H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-2/6）。

13C NMR（125 MHz，CD3OD）：δC31.2（C-7），37.2（C-8），116.2（C-3,C-5），133.0（C-1），130.2（C-2,C-6），156.7（C-4），177.0（C-9）。

分析NMR 数据并与文献[26]比对，确定化合物为对羟基苯丙酸。

2.1.7 化合物7 化合物7 为浅黄色针状结晶，在甲醇/水（体积比为4∶1）的C18TLC 的Rf值为0.8，硫酸-茴香醛显色无色。该化合物易溶于DMSO。核磁波谱数据如下。

1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δH5.44（1H，d，J=7.6 Hz，H-5），7.37（1H，d，J=7.6 Hz，H-6），10.94（2H，brs，1-NH/3-NH）。

13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δC100.2（C-5），142.3（C-6），151.6（C-2），164.3（C-4）。

分析NMR 数据并与文献[27]比对，确定该化合物为尿嘧啶。

2.2 HPLC 指纹图谱

为了考察盐酸普鲁卡因对海洋真菌黑甲肉座菌Hypocrea lixii次生代谢产物的影响及化合物来源，对大豆培养基提取物及H.lixii在不同条件下（添加或未添加盐酸普鲁卡因的大豆培养基）发酵提取物的指纹图谱做了对比。

结果如图2 所示，在大豆培养基提取物及正常大豆培养基中菌株的发酵提取物（图2-A和图2-B）中均未能检测到化合物1，而在添加了盐酸普鲁卡因的Soy 培养基中该原始菌株的代谢物（图2-C）能够产生化合物1。化合物2～4 在大豆培养基提取物指纹图谱（图2-A）中也观察到了保留时间相近、紫外吸收特征相同的峰。

化合物5 仅存在于添加了诱导剂盐酸普鲁卡因的发酵提取物中，而化合物6 在有无添加诱导剂的发酵产物中都存在，而未见于大豆培养基提取物中（相同保留时间处虽有色谱峰，但紫外光谱有差异），化合物7 也主要存在于两种发酵产物中，在大豆培养基中未见明显色谱峰。

另外，加了盐酸普鲁卡因诱导的菌株能产生一些仅在大豆培养基中发酵所不能产生的代谢物（如保留时间4.9 min、6 min、20 min、28.5 min 处的峰），同时还能刺激H.lixii提高某些在大豆培养基中发酵代谢产物的产量（如保留时间1.0～2.5 min 及8 min 处的峰），这些代谢产物的结构还有待进一步研究。

图2 254 nm 下大豆培养基及Hypocrea lixii DLEN2008010 不同培养条件发酵提取物的HPLC 指纹图谱.Fig.2 The 254 nm detected HPLC fingerprints for soybean cultural medium and Hypocrea lixii DLEN2008010 fermentation extracts under different cultural conditions.

2.3 抗氧化活性

采用Sharma 和Bhat 描述的DPPH 自由基清除法对化合物1～6 进行抗氧化活性评价，化合物7 因为考虑到只是普通的碱基，故未测活性。结果显示，化合物1～4 在100 μmol/L 剂量浓度下显示了较弱的DPPH 自由基清除活性（表1）。

表1 化合物1～ 4 的DPPH 自由基清除活性Table 1 The DPPH free radical scavenging activities of compounds 1– 4

2.4 乙酰胆碱酯酶抑制活性

采用改良的Ellman比色法对化合物1～6进行抗乙酰胆碱酯酶活性评价。结果显示，在100 μmol/L剂量浓度下化合物1～4 活性较微弱，而化合物5 和6 活性相对较明显（表2）。

表2 化合物1～ 4 的AChE 抑制活性Table 2 The inhibitory activities for AChE of compounds 1– 4

3 讨论

本实验中，化合物1 仅在添加了化学诱导剂的发酵产物中被检测到，推测是在诱导剂的刺激下，菌株相关代谢基因被激活，从而利用大豆中的异黄酮代谢产生了化合物1。该化合物首次被发现是从红曲霉发酵黑豆中分离得到的[21]，本文为其第二次报道，也是首次从Hypocrea lixii发酵大豆中分离得到。化合物2～4 则普遍存在于大豆中[28]，在大豆培养基提取物指纹图谱中也存在，因此推测它们源自培养基。

从结构相关性上推测，化合物5 与盐酸普鲁卡因均含有对氨基苯甲酸片段，推测该化合物为盐酸普鲁卡因被真菌代谢所产生，这也是该化合物生物转化来源的首次报道。

化合物6 在有无添加诱导剂的发酵产物中都存在，而在大豆培养基提取物中未检测到，而且该化合物曾从海洋细菌、多黏类芽孢杆菌、陆生真菌等微生物以及小叶榕等来源分离得到（而未见于大豆中报道）[26,29-31]，因此我们推测它为H.lixii的代谢产物，本研究为首次从真菌Hypocrea lixii中分离得到。化合物7 则为生命基础代谢成分，推测真菌发酵使得大豆的核酸类成分降解从而提高了其含量。

表观遗传修饰是一种运用较方便的化学诱导手段，其主要作用机制是通过抑制DNA 甲基转移酶酶或组蛋白去乙酰化酶，从而使染色体的结构局部松散化，利于DNA 与转录因子的结合，从而促进沉默基因的表达和相应次级代谢产物的产生[32]。在利用该手段对真菌进行化学表观遗传修饰时，菌株对诱导剂种类及其剂量的敏感性非常重要，普鲁卡因是一种DNA 甲基转移酶抑制剂，De Feliciode等发现普鲁卡因与丙戊酸共同作用可促进炭角菌代谢[33]，在本研究之前对一株海洋爪曲霉的研究中，发现普鲁卡因与NaBr 可协同诱导菌株产生2 种缩酚酸环醚类化合物[34]。本实验中也发现普鲁卡因导致H.lixii可产生仅此条件下出现的化合物1 及一些尚待鉴定的化合物，并提高一些代谢产物的产量。上述表明该表观遗传修饰剂有较广泛的作用对象。

在活性筛选中，化合物1～6 显示了较弱的抗氧化及乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中化合物5 和6 的乙酰胆碱酯酶抑制活性相对较强（未见前人报道），考虑到化合物1 的2 个类似物曾从黄芪中分离得到并被报道具有抗炎活性[35]，化合物5 及其衍生物曾被报道具有促进间充质干细胞分化为成骨细胞的促骨再生作用[36]，化合物6 曾被报道具有抗炎活性[31]，这些化合物的活性还有待进一步扩大筛选研究以挖掘其应用价值。该菌株提取物中的其他成分也有待继续进行深入分离鉴定及活性研究。

4 结论

本研究对一株海洋真菌Hypocrea lixiiDLEN2008010 采用盐酸普鲁卡因进行化学诱导，从中分离鉴定了7 个化合物，并研究了其抗氧化及乙酰胆碱酯酶抑制活性。其中化合物1 是从Hypocrea lixii分离得到的首个具有丁烯酰侧链的染料木素糖苷，化合物6 也为首次该菌中分离得到，丰富了该菌的次级代谢产物多样性。化合物5 为生物转化来源的首例报道。化合物5 和6 表现了一定程度的乙酰胆碱酯酶抑制活性，为首次报道。盐酸普鲁卡因对该菌的次生代谢有显著影响，该菌株的化学成分研究工作还在继续深入进行之中，有待后续报道。