过热蒸汽对熟制小龙虾优势腐败菌的杀菌动力学及其机理

张泽伟，段伟文，陈 铭，邓楚津，刘书成,2,3,4，吉宏武,2,3,4

（1.广东海洋大学食品科技学院/ 2.广东省水产品加工与安全重点实验室/ 3.广东省海洋食品工程技术研究中心/4.水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088）

小龙虾，学名克氏原螯虾（Procambarus clarkii），自1929 年引入我国后，被大范围推广养殖。2016 年，我国已是全世界最大小龙虾生产国，其加工产业快速发展的同时也遇到了诸多问题[1-2]。与其他冷藏水产品相比，小龙虾含有较多自由氨基酸，致使其更容易遭受微生物作用而腐败变质，货架期较短，成为限制小龙虾产业进一步发展的主要障碍[3]。如何有效地杀灭小龙虾产品中腐败菌，前人已有相关杀菌方式的研究报道。其中巴氏灭菌能较大程度保持小龙虾产品灭菌后品质，但杀菌效果不理想。高温高压灭菌能较好杀灭微生物，但对产品风味与口感等影响较大[4]。因此选择合适杀菌方式是小龙虾产业急需解决的问题。

过热蒸汽是指在恒定的压力下对饱和蒸汽继续加热，使其温度升高到相应沸点以上的高温水蒸气[5]。与传统热处理方式相比，过热蒸汽的传热方式除对流传热和辐射传热，还有冷凝传热；在杀菌过程中蒸汽在物料表面冷凝，释放大量的热，使物料快速升温同时大幅度杀灭微生物，缩短杀菌时间，保障产品品质。且在杀菌过程中过热蒸汽提供低氧环境，避免氧化反应，降低有害物生成。近些年过热蒸汽杀菌作为一种绿色热加工技术而备受关注[6]。目前，研究已发现过热蒸汽对大肠杆菌（Escherichia coli）[7]、嗜热芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）[8]、沙门氏菌（Salmonella）[9]等微生物具有良好的杀菌效果。然而，过热蒸汽杀菌技术对小龙虾产品优势腐败菌杀灭效果的研究尚未有文献报道。

微生物杀菌动力学研究是杀菌技术运用的关键理论之一，它可以定量评价杀菌的效果、提供合适的杀菌设计标准，对杀菌技术的实际应用具有理论指导意义[10]。目前，已研究多种杀菌技术对不同微生物的杀菌动力学，例如超声辅助超临界CO2杀灭大肠杆菌（E.coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的动力学[11]，微波和巴氏灭菌杀灭大肠杆菌O157：H7（Escherichia coliO157：H7）和李斯特菌（Listeria monocytogenes）的动力学[12]和过热蒸汽杀灭沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌的杀菌动力学[13]。然而，过热蒸汽对小龙虾优势腐败菌的杀菌动力学还未见有研究报道。

本研究以从腐败小龙虾产品中分离的优势腐败菌为研究对象，研究不同条件下过热蒸汽温度、流量和处理时间对小龙虾产品优势腐败菌的杀菌效果及动力学，并初步探究其杀菌机理，以期获得过热蒸汽杀灭小龙虾产品优势腐败菌的最佳条件，为指导过热蒸汽在小龙虾产品加工中的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活小龙虾（Procambarus clarkii），30～ 36 尾/kg，购于广东省湛江市霞山区东风海鲜市场；营养肉汤(NB)、PCA 平板计数琼脂、革兰氏染色试剂盒，北京陆桥技术股份有限公司；Taq DNA 聚合酶、PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；基因组DNA 提取试剂盒，天根生化科技有限公司；体积分数25%戊二醛、无水乙醇、叔丁醇，均为分析纯，广东光华科技股份有限公司。

1.2 主要实验仪器和设备

JSM-7610F 扫描电子显微镜，日本电子株式会社；SW-CJ-FD 洁净双人工作台，苏州净化设备有限公司；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；Hema 9600 PCR 基因扩增仪，珠海黑马医疗仪器有限公司；SLI-700 埃朗生化培养箱，东京理化器株式会社；HZQ-X100 全温振荡培养箱，苏州培英实验设备有限公司；FDU-1100 真空冷冻干燥设备，东京理化器械株式会社；Aglient Cary 60 紫外-可见光光度计，美国安捷伦科技公司；DDSJ-308A 电导率仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；过热蒸汽处理系统，自制[14]。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备 新鲜小龙虾→超声清洗→沥干→油炸（170 ℃油炸3 min）→煮制（含5 g/100 mL食盐的沸水中煮10 min）→冷却→真空包装→25 ℃下贮藏。

1.3.2 贮藏期间菌落总数与挥发性盐基氮含量测定 每天测定熟制小龙虾的菌落总数与挥发性盐基氮含量。菌落总数测定方法参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》；挥发性盐基氮采用自动凯氏定氮仪法测定，参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》。

1.3.3 腐败菌的分离纯化与鉴定 选取贮藏终点的小龙虾样品，在无菌超净台中将小龙虾去头、去壳，称取25 g 虾肉，用无菌剪刀剪碎后放入盛有225 mL 无菌生理盐水的锥形瓶中，均质。按10 倍系列稀释，稀释至10-5。取100 μL 菌悬液均匀涂抹在营养琼脂上，在37 ℃下，恒温培养48 h 左右。挑选一个合适的平板（菌落数约30～100 CFU）计数，并挑起平板上全部可见菌落，进行编号，连续进行3 次划线分离。用体积分数为20%甘油-80 ℃保存，以备后用。根据革兰氏染色、细菌形态和菌落特征将获得的菌株分组。将所有纯菌株进行16S rDNA 的PCR 扩增，其产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序[15]。将测序结果在NCBI 网站上进行BLAST 系列分析，选取相似性99%以上菌株的基因序列，利用MEGA5.1 软件进行邻近法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。

1.3.4 菌悬液的配制 用接种环挑取一环小龙虾的优势腐败菌接入无菌的营养肉汤（NB）中，180 r/min、37 ℃振荡培养24 h，连续重复3 次[16]。将培养好的细菌菌悬液离心（5 000 r/min,15 min，4℃）。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮在生理盐水中至所需浓度，浓度范围为108～ 109CFU/mL[17]。

1.3.5 过热蒸汽杀菌实验过程 首先设置好过热蒸汽仪器的温度、流量等参数（温度参数为170、200、230 ℃，流量参数为19、24、29 m³/h），待整个系统温度和流量稳定后，关闭阀门，快速将3根装有4 mL 菌悬液的18mL 玻璃试管放在物料放置架上，关闭箱门。重新打开蒸汽阀门，同时记录杀菌时间（杀菌时间为40、70、100、150、200、250、300 s）。杀菌完成后，将试管立即放入冰水中冷却，直至微生物计数检测[18]。

1.3.6 微生物计数 参照方法1.3.2 中菌落总数测定的方法检测腐败菌在过热蒸汽处理前、后的数量。过热蒸汽的杀菌效果采用微生物残活率表示，见公式（1）。

过热蒸汽处理前的菌悬液的菌落总数记为N0（CFU/mL）；过热蒸汽处理后菌悬液的菌落总数记为N（CFU/mL）。

1.3.7 杀菌机理的菌悬液制备 按照1.3.4 的方法配制菌悬液，再按照1.3.5 的方法对菌悬液进行杀菌，具体的过热蒸汽杀菌条件：过热蒸汽温度230 ℃、流量29 m³/h，处理时间分别为：0、40、70、100、150、200、250 s。

1.3.8 菌悬液电导率测量 对按照1.3.7 的方法所制备的菌悬液，使用电导率仪测定其电导率值。

1.3.9 菌悬液紫外吸收测量 对按照1.3.7 的方法所制备的菌悬液进行离心（5000 r/min,15 min，4 ℃），取上清液，在波长260 nm 处测定其吸光值。

1.3.10 细菌微观形态的观察 借助扫描电子显微镜对小龙虾产品的优势腐败菌菌株细胞形态进行观察。对按照1.3.7 的方法所制备的菌悬液进行离心（5 000 r/min,15 min，4 ℃，弃去上清液，下同），再加入0.1 mol/L pH＝7.0 的PBS 缓冲液，离心。加入适量的体积分数2.5%的戊二醛溶液固定过夜后离心。加入PBS 缓冲液，离心，重复3 次。分别加入30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇逐级洗脱，每级洗脱10 min，离心，其中100%的乙醇洗脱2 次，其余洗脱1 次。再加入无水乙醇与叔丁醇（体积比＝1∶1）洗脱15 min，离心。最后叔丁醇洗脱15 min，离心。得到的菌泥再经真空冷冻干燥后，固定在金属箔片上，喷金80 s，电镜观察。

1.4 杀菌动力学数学模型--Weibull 模型

式中，b为尺度参数，n为形状参数，t为过热蒸汽处理时间(s)。当n=1，曲线为一条直线，此时Weiibull 模型为一级动力学方程；当n＞ 1，曲线呈凸形；当n＜ 1，曲线呈凹形。

1.5 数据分析

每个实验重复3 次，数据用“平均值±标准差”表示，使用Origin 8.5 软件对实验数据进行拟合分析并绘图。

2 结果与分析

2.1 熟制小龙虾贮藏期间菌落总数和挥发性盐基氮变化

菌落总数直接反映熟制小龙虾产品被细菌污染的程度和是否符合卫生要求，所以菌落总数在一定程度上表示小龙虾产品是否具有可食性。挥发性盐基氮含量表示小龙虾产品由于受到微生物和酶的作用，本身蛋白质被分解产生氨和胺类等碱性含氮物质的程度[19]。图1 是熟制小龙虾在常温下（25 ℃）贮藏过程中菌落总数和挥发性盐基氮含量的变化，由图1 可知，贮藏期间小龙虾菌落总数一直持续增长，挥发性盐基氮含量先缓慢增加后急剧上升。孙亚军等[20]研究南美白对虾虾仁贮藏期间挥发性盐基氮的变化规律，发现挥发性盐基氮含量先缓慢增加后快速增加。熟制小龙虾贮藏期间挥发性盐基氮含量的增长规律与其类似。这是由于贮藏前期，产品微生物的数量较少，蛋白质被分解的程度较低，碱性含氮物质的含量较少。随着贮藏时间延长，微生物数量增加，分解作用变强，从而使挥发性盐基氮含量增加[21]。根据GB 10136-2015《食品安全国家标准 动物性水产制品》，判定熟制小龙虾达到腐败终点的菌落总数限量为 5×104CFU/g，挥发性盐基氮限定值为30 mg/100 g。贮藏2 d，小龙虾的菌落总数为4.47×105CFU/g，已超过限定值，此时挥发性盐基氮含量为19.45 mg/100 g还未超标，挥发性盐基氮指标滞后于菌落总数指标。综合来看，贮藏2 d 的熟制小龙虾已腐败变质，到达货架期的终点。

图1 熟制小龙虾菌落总数和挥发性盐基氮含量随贮藏时间的变化Fig.1 Change in total bacterial count and TVB-N value of cooked crayfish during storage

2.2 小龙虾优势腐败菌的分离与鉴定

根据1.3.3，从稀释度为10-3的平板上共挑取56 个菌落，然后分别划线分离纯化。根据图2 可知，小龙虾优势腐败菌构建的系统发育树可判定A1 号菌为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）；B2 号菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；C12号菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）；D4 号菌为赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus macroides）。它们均为革兰氏阳性菌，并分别占挑取分离总菌落的19.64%、14.29%、42.86%和23.21%。

图2 4 种优势腐败菌系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of four dominant spoilage bacteria

从小龙虾产品中分离出的蜡样芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌与相关文献报道一致[22]。而解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌是首次在腐败小龙虾产品中被发现。在真空包装中，革兰氏阳性菌的数量远远大于革兰氏阴性菌[23]。蜡样芽孢杆菌、解淀粉枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌均被认为是熟制食品的优势腐败菌，均在小麦面包[24]、鱼糜[25]和烤鸡[26]等中被发现。因煮制的杀菌温度较低，同时解淀粉枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌具有良好耐热性，所以他们能够在煮制过程中存活并在贮藏期间生长繁殖。因此解淀粉枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌能够在经煮制后的小龙虾产品中大量存在并成为小龙虾的优势腐败菌。

2.3 过热蒸汽温度和杀菌时间对小龙虾优势腐败菌的杀菌动力学

研究过热蒸汽流量为24 m³/h、不同过热蒸汽温度和杀菌时间对4 种优势腐败菌的灭活效果，其结果如图3 所示。在整个杀菌过程，随着杀菌时间延长，微生物残活率持续下降，直到完全杀灭。但整个过程，微生物残活率下降的速率是不同的。在杀菌初始阶段，4 种优势腐败菌的残活率均迅速下降，并呈现类似的趋势。然后随着过热蒸汽处理时间的延长，4 种优势腐败菌的残活率变化缓慢，趋于平缓。此外，过热蒸汽对4 种小龙虾优势腐败菌的杀菌动力学所拟合的生存曲线均为“拖尾”曲线。这是由于在过热蒸汽处理初期，过热蒸汽遇见冷试管时，蒸汽在试管表面冷凝，释放出大量的热量并传递给菌悬液，使其温度快速升高，从而快速的杀死菌悬液中存活的细菌。随着过热蒸汽的处理，菌悬液中存在的热敏性细菌个体被杀灭，留下耐热性较强的细菌个体，导致残活率下降速率变慢[27]。上述趋势与过热蒸汽杀灭嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（Geobacillus stearothermophilusspores）的过程类似[28]。这种趋势不仅与杀菌工艺有关，还与细菌细胞壁有关。4 种小龙虾优势腐败菌均为革兰氏阳性菌。革兰氏阳性菌拥有多层肽聚糖和磷壁酸组成的坚固和厚实的细胞壁，磷壁酸有助于加强细胞壁的机械强度，从而提高细菌热耐性[29]。

杀菌效果也受过热蒸汽温度的影响。过热蒸汽对4 种小龙虾优势腐败菌的灭活效果与过热蒸汽温度呈正相关。在相同杀菌时间，过热蒸汽温度为230 ℃的杀菌效果要优于170 ℃。较高过热蒸汽温度使蒸汽在冷凝时释放大量的热和较强的气体辐射，因此使菌悬液的温度上升得更快，具有更高的微生物杀菌效率[30]。同时，不同腐败菌对不同过热蒸汽温度有不同的反应。蒸汽温度170 ℃，杀菌时间为250 s 时，解淀粉芽孢杆菌的残活率为-6.88，而在相同条件下，其他菌株对应的残活率均＜-8。在相同温度条件下，其残活率不同，可能与菌株本身的耐热性有关。在4 种小龙虾优势腐败菌中，B2菌株的耐热性最强。BOUKHRIS I 等发现解淀粉样芽孢杆菌具有很强耐热性[31]。总之，过热蒸汽对4种小龙虾优势腐败菌有较好的杀菌效果。过热蒸汽处理（200 ℃，250 s；230 ℃，200 s）后，其残活率均＜-8，杀菌效果均能达到近100%的致死率。

2.4 过热蒸汽流量对小龙虾腐败菌杀菌效果的影响

过热蒸汽温度为200 ℃，不同过热蒸汽流量的杀菌过程中，蒸汽流量对4 种优势腐败菌杀菌效果的变化趋势与蒸汽温度相似。其结果如图4 所示，在杀菌初期，残活率迅速减小。随处理时间的延长，腐败菌的残活率变化逐渐变缓慢。拟合不同蒸汽流量对小龙虾优势腐败菌的动力学曲线都呈带有“拖尾”的曲线。通过过热蒸汽（19 m³/h，300 s；24 m³/h，250 s；29 m³/h，200 s）处理后，小龙虾优势腐败菌能被完全杀灭，其杀菌效果均能达到近100%的致死率。

图3 在24 m³/h 蒸汽流量下杀菌处理小龙虾产品优势腐败菌的存活曲线Fig.3 Survival curves of dominant spoilage bacteria from crayfish product after different 24 m³/h steam flow rate

图4 在200℃蒸汽温度下杀菌处理小龙虾产品优势腐败菌的存活曲线Fig.4 Survival curves of dominant spoilage bacteria from crayfish product after different superheated steam flow rates,treatment time and 200 ℃ steam temperature

2.5 Weibull 模型参数及拟合评价

运用Weibull 模型拟合不同过热蒸汽温度、流量和杀菌时间因素下杀灭4 株小龙虾优势腐败菌后残活率的曲线。由表1 可知，Weibull 模型的R2≥0.935，表明Weibull 模型对过热蒸汽灭活小龙虾产品中优势腐败菌的所有动力学都具有较高拟合度。Weibul 模型因只有2 个参数b、n，具有一定的简洁性、灵活实用性，可避免过度参数化[32]。尺度参数b反映过热蒸汽参数与杀菌效果间相关性，形状参数n反映曲线的形状。由表1 可知，参数b随着过热蒸汽温度、流量的增大而增大，说明过热蒸汽参数与杀菌效果呈正相关，所以提高过热蒸汽温度和增大流量，更容易到达灭活腐败菌的效果；参数n的值均小于1（表1），表明拟合曲线的形状为先迅速下降，后趋于平缓，呈凹形。因此，延长杀菌时间并不能够提高整个杀菌过程的杀菌效率[33]。为避免拖尾现象发生、提高过热蒸汽杀菌效果和保障产品品质，过热蒸汽对小龙虾腐败菌的杀菌过程应提高过热蒸汽温度、增大流量、缩短杀菌时间。

表1 Weibull 模型参数和R2Table 1 Weibull model parameters and R2

为衡量实际值与预测值的接近程度，以过热蒸汽温度、流量所有的实测值分别为横坐标，模型预测值为纵坐标作图，进行线性拟合，其结果如图5所示。实测值与预测值越接近，其关系曲线的斜率a、决定系数R2均接近于1，截距b接近于0。由图5 可知，过热蒸汽温度和流量的线性回归方程分别为y=0.984 11x-0.090 6（R2=0.984 98）、y=0.978 6x-0.127 73（R2=0.979 31）。斜率a、截距b分别为a=0.984 11、0.978 6；b=0.090 6、0.127 73。斜率a、R2均接近1，截距b接近于0，说明Weibull 模型得到的预测值与实测值接近程度很高。

图5 过热蒸汽温度和流量对小龙虾腐败菌杀菌效果的实测值和预测值的相关性Fig.5 Correlation between measured value and predicted value for inactivation effects of spoilage bacteria in crayfish by steam temperature and flow rate

2.6 杀菌机理初探

2.6.1 电导率及紫外吸收 细胞膜是维持细胞完整和细胞正常物质运输、能量代谢的重要结构，当细菌的细胞膜受到破坏时，细胞膜失去控制物质运输的功能，细胞内电解质大量外流，导致菌悬液的电导率升高。同时膜内小分子物质和核酸等大分子物质也随之流出，这些核酸物质在波长260 nm 处有吸收[34]。因此通过测量菌悬液的电导率和260 nm吸光度的变化情况，了解菌体在过热蒸汽处理后细胞膜的受损情况。从图6-a 可知，0～ 40 s，菌悬液的电导率数值上升最快，40～ 250 s，菌悬液的电导率上升的速率比前40 s 缓慢。如图6-b 所示，菌悬液在260 nm 的吸光度随着过热蒸汽处理时间延长呈不断上升趋势，先快速升高后平缓增加。电导率与吸光度的变化表明在过热蒸汽处理40 s后菌悬液中已有大量菌体的细胞膜受到破坏[35]。电导率和紫外吸收的变化规律与小龙虾产品优势腐败菌的存活曲线（图3、图4）具有一致性。在杀菌初始阶段，大量优势腐败菌被杀灭，随着过热蒸汽处理时间延长，过热蒸汽的杀菌速率变缓慢，最后趋于稳定。

图6 小龙虾产品优势腐败菌电导率和紫外吸收随过热蒸汽处理时间的变化Fig.6 The changes of conductivity and UV absorption of the dominant spoilage bacteria from crayfish product treated with superheated steam treatment time

2.6.2 细菌微观形态的观察 图7 表示小龙虾优势腐败菌蜡样芽孢杆菌的微观形态随过热蒸汽处理时间的变化。从图7-A 观察可知，未经过热蒸汽处理的细胞具有规则的长杆状，形态丰满、完整、未变形，细胞表面光滑，无破裂，无内容物外泄现象。过热蒸汽处理40 s（图7-B）后，菌体保持较完整的杆状，但细胞表面变粗糙，出现不规则的褶皱，表现为凹凸不平，同时存在内容物外泄现象，此时菌体形态已遭到破坏，细胞膜或细胞壁已破裂，导致菌悬液的电导率和紫外吸收数值的增加。过热蒸汽处理150 s 和250 s 后（图7-C 和图7-D），菌体形态扭曲变形，菌体四周不完整，破损和断裂严重，甚至有些菌体破裂成细胞碎片。结果表明，随过热蒸汽处理时间延长，改变了菌株外部形态，并对细菌的细胞壁膜造成不可逆的损伤，以及胞内物质外流，从而导致菌体死亡。

图7 过热蒸汽分别处理0、40、150、250 s 蜡样芽孢杆菌的扫描电镜图Fig.7 Scanning electron microscopy of Bacillus cereus at different inactivation time with superheated steam

3 结论

采用稀释涂布平板法，从腐败的小龙虾产品中分离出优势腐败菌，经重复划线纯化得到纯菌落。根据优势腐败菌的16S rDNA 基因序列将其鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus macroides）。Weibull 模型能较好拟合过热蒸汽温度、流量和杀菌时间对熟制小龙虾优势腐败菌的灭活动力学，其R2≥0.935。经过热蒸汽处理后，4 种小龙虾产品的优势腐败菌均能被完全杀灭。提高过热蒸汽温度和流量可以使过热蒸汽对熟制小龙虾腐败菌的整体杀菌效果得到提升。同时通过对过热蒸汽处理后菌悬液电导率和吸光度测量，以及对菌体微观结构的观察，表明过热蒸汽杀菌使菌体细胞膜遭到严重变化，使细菌形态发生变化，造成胞内物质外流，致使腐败菌死亡。本研究结果证实过热蒸汽是在小龙虾产品加工杀菌过程中一种有前途的杀菌技术。