方格星虫酶解物对小鼠皮肤创伤修复的作用

2020-01-16 07:06郑志鸿章超桦林海生曾少葵秦小明曹文红
广东海洋大学学报 2020年1期
关键词:羟脯氨酸方格造模

郑志鸿,章超桦,2,林海生,曾少葵,秦小明,曹文红

(1.广东海洋大学食品科技学院// 广东省水产品加工与安全重点实验室// 广东省海洋食品工程技术研究中心// 水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,广东 湛江 524088;2.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心,大连工业大学,辽宁 大连 116034)

伤口愈合是一种复杂且高度协调的生物修复活动,主要包含止血期、炎症期、增殖期和重塑期等一系列阶段[1]。当机体皮肤遭受创伤后,皮肤的连续性遭到破坏,损伤部位血管破裂,造成血液流失和局部炎症反应,同时细菌、病毒等环境污染物容易造成感染,延迟伤口愈合,留下瘢痕,严重则会危及生命,因而必须及时恢复皮肤完整性,重新建立体内平衡机制,预防感染与减少体液流失,同时预防异常瘢痕形成。我国每年遭受皮肤急性创伤人数都超过1 000 万[2],研制新的促进创伤愈合制剂具有很高的临床应用价值。

方格星虫(Sipunculus nudus)又称沙虫,国内主要分布在北部湾、福建、台湾等地沿海滩涂[3],营养丰富,味道鲜甜。我国对方格星虫的加工利用较少,主要用于鲜销和加工成干制品,近几年其深加工价值越来越受到重视,其活性研究和应用也日益广泛。现代医学研究表明方格星虫具有抗氧化[4]、抗疲劳[5-7]、抗病毒[8]、调节免疫[9-11]、抗菌[12-13]、抗炎和外周镇痛[14]等功效,其中免疫调节、抗菌和抗炎功效与伤口愈合密切相关。研究团队前期研究表明,方格星虫酶解产物具有免疫调节功能[10],同时方格星虫中精氨酸含量极高[15]。精氨酸的摄入可以降低机体氮的损失,具有促进伤口愈合的功能[9]。又有研究表明,可口革囊星虫胶原蛋白可以促进皮肤创伤修复[16],作为同属的方格星虫也可能有相似功效。本试验拟制备方格星虫酶解物,并从止血期、炎症期、增殖期探讨其促伤口愈合的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与原料 选取体重为(20.0 ± 2.0)g的SPF 级KM 小鼠,由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。动物生产许可证为:SCXK(鲁)20140007。于23~ 25 ℃、相对湿度为50%~ 60%进行日常饲养,自由饮水,进食。自湛江市东风市场购买方格星虫成虫,直径5~ 7 mm,长8~ 12 cm,去除泥沙、内脏和体腔液,蒸馏水洗净体壁,沥干后,于-20℃贮藏。

1.1.2 试剂 动物水解蛋白酶(2×105U/g)、风味蛋白酶(2×105U/g),广西南宁庞博生物科技有限公司;ELISA 试剂盒、羟脯氨酸试剂盒(碱水解法),南京建成生物工程研究所;云南白药,云南白药集团股份有限公司;医用酒精、生理盐水、水合氯醛,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

Thermo Varioskan Flash 多功能全自动酶标仪、Thermo Lynx6000 高速落地离心机,美国Thermo公司PHS-25 pH 计,上海康仪仪器有限公司;R1005 DL 旋转蒸发仪,郑州长城科工贸有限公司;G50组织研磨仪,卡尤迪生物科技(北京)有限公司;Rapid-Core 打孔器,美国EMS 公司;FB224 电子分析天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 方格星虫酶解物制备工艺 参照研究团队前期酶解工艺[10],将方格星虫充分绞碎,调节pH至7.0,按料液比1∶3(g/mL),2 500 U/g 分别加入动物水解蛋白酶和风味蛋白酶,充分匀浆,55℃恒温搅拌水浴锅,提取5 h,沸水浴灭酶10 min,以8 000g离心20 min,取上清液旋蒸浓缩,冷冻干燥得方格星虫酶解物(以下简称SNH)。

1.3.2 方格星虫酶解物体外止血活性研究 27 只小鼠,体质量 30~ 35 g,随机均分为空白组(none-treatment,NT)、SNH 组和云南白药对照组(positive control,PC),将小鼠置于特定容器中固定,并使其尾巴呈水平状态露出,用医用手术剪于尾端0.4 cm 处截断,用医用棉签粘取药物轻轻包裹于鼠尾断面,SNH 组蘸取1 g·kg-1给药,PC 组也用医用棉签蘸取1 g·kg-1;NT 组不给药,开始计时,每隔10 s 用滤纸轻轻吸取尾巴流下的血滴,不可挤压伤口,记录滤纸不再粘下血迹所用时间,为止血时间。

1.3.3 建立伤口模型 将小鼠适应性饲养一周后,随机分为3 组,分别为NT 组、SNH 组和PC 组。将老鼠以350 mg·kg-1水合氯醛麻醉,背部去毛,消毒后,用直径8 mm 圆形医用打孔器于老鼠背部切取全层皮肤,深至筋膜,形成全皮层皮肤创伤动物模型,分笼饲养。SNH 组以SNH(以氮计)与水质量比2∶1 配成膏状,涂抹伤口,涂满为止;PC组也以涂满为主,NT 组不予给药。每天给药一次。每2 d 固定高度拍照一次,用Image J 软件分析计算伤口愈合率,计算公式:

式中S0代表0 d 创面面积,SN代表Nd 创面面积,单位:mm2,其中N=0,2,4,…,14。

1.3.4 ELISA 分析 将造模3、5 和7 d 后的小鼠,各组分别处死5 只,剪取创面全层皮肤及创周2.0 mm 的正常皮肤,参照南京建成相应的ELISA 试剂盒说明书测定创面中的肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β) 和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的浓度 。

1.3.5 HE 染色切片分析 造模后7 d,取创面全层皮肤及创周皮肤对半切开,用体积分数4%多聚甲醛固定12 h,经脱水、包埋和切片,制成石蜡切片,用苏木素-伊红(hematoxylin and eosin stain,HE)染色,观察痂覆盖下的创面宽度。

1.3.6 羟脯氨酸含量测定 取造模后7 d 和14 d 小鼠创面及周边的皮肤一半用于测定羟脯氨酸含量,参照南京建成的羟脯氨酸试剂盒(碱水解法)说明书进行测定。

1.3.7 数据统计与分析 采用JMP10、Image J 和Origin9.0 软件统计分析、处理图片和作数据图。结果表示为平均值±标准差,所有图片图注中的n代表动物个数。对所有数据进行组间差异性显著分析,采用最小二乘均值studentt检验。组间统计显著性水平α值:组间大写字母表示α=0.01,组间小写字母表示α=0.05。

2 结果与分析

2.1 止血作用分析

各组止血时间如图1 所示,SNH 组和PC 有相似的止血效果,出血时间无显著性差异,均显著短于NT 组。各组出血时间分别为:NT (236.75 ± 62.61)s、SNH (120.00 ± 41.50) s 和PC (86.17 ± 67.41) s。

图1 SNH 对小鼠尾部出血时间的影响Fig.1 Effects of SNH (Sipunculus nudus hydrolysate)treatment on tail bleeding time in mice

2.2 创面愈合率

各组创面愈合情况如图2 所示,随着伤后时间延长,各组小鼠创面面积均逐渐减小,造模后2 d均有软痂覆盖伤口。如图3 所示,SNH 组在造模后2 d 至14 d 的创面愈合率均显著高于NT 组,PC 组在造模后2 d 至6 d 以及造模后14 d 的创面愈合率均显著高于NT 组,SNH 组与PC 组比较均无显著性差异。在造模后8 d,各组愈合率分别为SNH 组[(82.78 ± 8.63)%]Aa、PC 组[(71.48 ± 5.48)%]Aab和NT组[(59.03 ± 22.68)%]Ab;造模后14 d,为SNH 组[(99.62 ± 0.80)%]Aa、PC 组[(96.27 ± 4.39)%]ABa和NT 组[(89.35 ± 5.37)%]Bb。图4 所示是各组掉痂时间,分别为:SNH 组[(12.8 ± 0.6)d]Bc、PC 组[(14.0 ±1.4)d]Bb和NT 组[(17.0 ± 1.5)d]Aa。SNH 组掉痂时间显著短于PC 组和NT 组,PC 组显著短于NT 组。

2.3 创面组织中 IL-1β 和TNF-α 水平

创面中的IL-1β 水平如图5 所示,造模后3 d,SNH 组和PC 组 IL-1β 水平明显高于NT 组。造模后5 d,SNH 组和PC 组IL-1β 水平显著下降,与NT组无显著差异。造模后7 d,SNH组和PC组IL-1β水平显著低于NT 组。创面中的TNF-α 水平如图6所示,造模后3 d,SNH 组和NT 组TNF-α 水平无明显差异,PC 组TNF-α 水平显著大于SNH 组和NT 组。造模后5 d,SNH 组和PC 组TNF-α 水平有所下降,其中SNH 组的TNF-α 水平显著低于NT组和PC 组,PC 组与NT 组无显著差异。造模后7 d,SNH 组和PC 组TNF-α 水平显著低于NT 组。

图2 宏观观察NT、SNH 和PC 组小鼠伤口的愈合情况Fig.2 Macroscopic observation of the wound healing of NT,SNH and PC group

图3 SNH 对小鼠皮肤创伤愈合率的影响Fig.3 Effect of SNH group on wound closure in mice

图4 掉痂所用的时间Fig.4 Time of scab removal

图5 SNH 对皮肤创面IL-1β 的影响Fig.5 Effect of SNH on IL-1β in wound of mice

图6 NH 对皮肤创面TNF-α 的影响Fig.6 Effect of SNH on TNF-α in wound of mice

2.4 创面组织的TGF-β1 水平

SNH 对小鼠创面组织TGF-β1 的影响,如图7所示。造模后7 d,相比于NT 组和PC 组,SNH 组创面组织TGF-β1 浓度显著降低,NT 组和PC 组无显著性差异。造模后14 d,SNH 组TGF-β1 浓度保持比较低的浓度,显著低于NT 组,与PC 组无显著性差异。

图7 SNH 对小鼠创面TGF-β1 的影响Fig.7 Effect of SNH on TGF-β1 in wound of mice

2.5 HE 染色切片分析

在造模7 d 后,用HE 染色测定各组对创面收缩的影响。如图8 所示,图中双向箭头之间宽度代表创面宽度,在痂的掩盖下,创口已经收缩修复,实现部分表皮再上皮化。各组宽度如图9 所示,分比为SNH 组(2.92 ± 0.22)mm 和PC 组(3.51 ±0.21)mm 均显著小于NT 组(4.58 ± 0.48)mm,其中SNH 组还显著小于PC 组。

图8 伤口组织HE 染色切片观察(造模后7 d)Fig.8 Histological observation of HE stained sections of wound at 7 days post-wounding

2.6 创面组织中羟脯氨酸的含量

SNH 对小鼠创面组织中羟脯氨酸含量的影响,如图10 所示。各组创面组织中的羟脯氨酸含量均随着时间的增加呈升高的趋势。在造模后7 d,NT组、SNH 组、PC 组和正常皮肤(normal skin,NS)羟脯氨酸含量分别为(4 158 ± 526) μg/mg、(4 820 ±1 066) μg/mg、(4 139 ± 1 404) μg/mg 和(9 327 ± 885)μg/mg,NT 组、SNH 组和PC 组无显著差异。造模后14 d,NT 组、SNH 组、PC 组和NS 组羟脯氨酸含量分别为(6 811 ± 1 172) μg/mg、(8 201 ± 431)μg/mg、(8 466 ± 1 086) μg/mg 和 (9 327 ± 885)μg/mg,SNH 组显著高于NT 组,与PC 组、正常皮肤无显著差异,这表明SNH 和云南白药有相似的功效,可以促进胶原蛋白在创面的沉积。

图10 SNH 对小鼠创面中羟脯氨酸含量的影响Fig.10 Effect of SNH on hydroxyproline content in wound of mice

3 讨论

造模后,SNH 组从造模后2 d 起,伤口愈合率一直显著高于NT 组,造模后7 d HE 染色切片表明SNH 组创面宽度显著小于PC 组和NT 组,可以促进创面收缩。造模后12 d,SNH 几乎完全愈合,造模后14 d,愈合后周边长满毛发,疤痕不明显,而NT 组14 d 时愈合率才(89.35 ± 5.37)%。此外,SNH组比NT 组早4.2 d 掉痂,比PC 组早1.2 d 掉痂,PC 组比NT 组早3 d 掉痂。这样的结果可能与SNH和云南白药在伤口愈合过程中快速止血、调节炎症因子、转化生长因子-β1 的表达和促进胶原沉积有密切联系。

SNH 组的止血时间显著短于NT 组,和PC 组无显著差异。据报道,云南白药可以增强血小板活化率,加速血小板向创面的聚集速度,缩短出血,具有很强的止血和促愈合效果[17]。这暗示SNH 在创伤后可以快速止血,减少体液流失,也减少细菌、病毒等环境染污物感染血液,其作用机制可能与方格星虫中的钙元素含量较高有关[6,18],其中钙离子是凝血因子IV,同时是多种凝血因子的辅因子,可以加速凝血酶的形成,参与凝血途径多个环节[19]。

从炎症反应来看,云南白药具有增强吞噬细胞的吞噬功能,提高机体免疫力,加速清创、消肿止痛等抗炎功效[17]。创伤前期SNH 组和PC 组一样,均促进炎症因子分泌,可以进一步激活炎性细胞,有助于伤口清除组织碎片、环境污染物,促使伤口快速清创[20]。此外,有研究报道方格星虫酶解物具有促进淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬的作用[10]。造模后7 d,SNH 组和PC 组的IL-1β 和TNF-α 均下降到比较低的水平,而NT 组则保持比较高的水平(图5、6),这表明SNH 不会导致过度炎症,致使愈合受损,这与Zhang 所提取的方格星虫水提物相似,具有一定的抗炎性,其方格星虫水提物对角叉菜胶诱导的大鼠后爪水肿、右旋糖酐诱导的大鼠足爪水肿、大鼠棉球肉芽肿、角叉菜胶诱导的腹膜炎、二甲苯诱导的小鼠耳水肿均有抑制作用[14]。炎症反应具有双面性,对于抵抗外源性异物和清除受损组织具有至关重要作用,可以保护组织免受外来抗原的侵害。然而,强烈持久的炎症会伤害自身正常组织,导致愈合受损[20-22],是与纤维化病理有关的发病的主要原因[23]。据报道,胎儿创伤和口腔黏膜伤口都表现出轻微的炎症水平,它们均能快速无疤痕愈合[24-27]。同时,IL-1β 和TNF-α 会以剂量依赖的方式来减少胶原合成[28],其中TNF-α 对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)有较强的促分泌作用,可促进胶原降解,对I/III 型前胶原信使RNA(Ribonucleic Acid,mRNA)转录具有阻断作用[29],不利于细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成,这都会致使愈合受损。

在愈合过程中,TGF-β1 是主要纤维化驱动因子,它与许多异常瘢痕的形成相关[30-32]。在胎儿伤口中,添加外源性TGF-β1 会导致与成年人一样的瘢痕形成作用[33]。造模7 d 后,相比于NT 组和PC组,SNH 组显示出比较低的TGF-β1 含量,这暗示SNH 可能有比较好的抗瘢痕效应。有研究表明在表皮上皮化的过程中,TGF-β1 抑制角质形成细胞和内皮细胞的增殖和存活[34],不利于血管生成和表皮再上皮化,而SNH 组TGF-β1 含量一直保持比较低的水平,低浓度的TGF-β1,还可以通过影响α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)、组织金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)和MMP 的mRNA 表达水平,使ECM 的合成与分解处于一种动态的平衡,促进ECM 的重塑,改善伤口表观[35]。

羟脯氨酸是胶原蛋白特异性成分,其占比相对比较固定,可用于创面中胶原蛋白的定量测定。据报道,云南白药能促进结缔组织的生长和血管的生成,加速形成肉芽[17]。造模后7 d,SNH 组羟脯氨酸含量高于NT 组,但无显著性差异,造模后14 d,SNH 组羟脯氨酸含量显著高于NT 组,与PC 组、正常皮肤无显著性差异,这代表了长期上药之后,SNH 组胶原的沉积显著优于NT 组,与PC 组一样具有促进胶原沉积的作用,其羟脯氨酸含量已经接近正常皮肤。原因也可能是SNH 本身作为ECM 基料,用于合成胶原蛋白,促进胶原沉积。

4 结论

综上所述,方格星虫酶解物能通过有效止血、调节炎症、转化生长因子-β1 以及加速胶原蛋白合成促进皮肤创伤愈合。

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