孙鲁浩,毛伟杰,吉宏武,刘书成,高 静,邵海艳
(广东海洋大学食品科技学院,广东 湛江 524088)
鱼类死后发生的自溶反应会导致三磷酸腺苷(ATP)降解形成二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、肌苷(HXR)和次黄嘌呤 (HX)[1]。学界通常把HX、HXR 含量之和对ATP、ADP、AMP、IMP、HXR、HX 含量之和的比值(称为K值)作为评价鱼类鲜度的重要指标。蒋晨毓等[2]分析鳙(Aristichthys nobilis)和棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)在4 ℃和0 ℃贮藏过程中ATP 关联化合物的变化,并把K值作为鱼类鲜度指标进行研究。但在鱼类研究中通常也利用另外一些鲜度指标反映不同鱼种的鲜度,如G值(HX、HXR 含量之和对AMP、IMP、HXR 含量之和的比值)和P值(HX、HXR 含量之和对AMP、IMP、HXR、HX 含量之和的比值)[3]。但是K值、G值和P值可否用来表征对虾鲜度尚无定论。
此外,因为ATP 关联化合物不仅与虾肉的鲜度有关,而且与对虾的呈味有关。AMP 可抑制苦味,产生甜味。IMP 是鲜味物质,可与谷氨酸钠(MSG)一起使用,产生比MSG 更强的风味增强效果。两者已广泛用作食品增味剂。HX 和HXR 是呈现苦味或不良风味的物质[4]。加热对虾肉中ATP 关联物质变化的研究较多,TAKASHI 等[5]对比短时高温和蒸煮的加热方式对鱼中ATP 相关化合物的影响,短时高温的加热方式有利于IMP 含量的保留,减缓IMP降解。Shinya 等[6]研究发现,日本对虾(Penaeusjaponicus)在加热过程中AMP 含量增加,甜味也增加。贠三月等[7]以生熟虾肉和生熟虾头作为研究对象对ATP 关联化合物进行呈味研究。池岸英等[8]采用微波和水煮加热方式对凡纳滨对虾(L.vannamei)熟制品和生虾的ATP 关联化合物进行呈味性比较。Zhang 等[9]研究虾肉在微波和水浴加热过程中ATP 关联化合物降解。Xu 等[10]采用蒸汽加热的方式将虾肉蒸至不同的温度,并对ATP 关联化合物呈味性进行量化分析。但是不同贮藏期的对虾加热后ATP 关联化合物怎样变化,K值、G值和P值可否用来评价烹饪后对虾品质鲜有报道。
对虾的呈味物质由多种物质决定,难以从某种物质量的多少来判断其呈味特点,所以需同时结合感官评估进行判断。但是加热过程中ATP 关联化合物的变化与感官评定值之间是否有相关关系尚不清楚。本研究通过比较贮藏期的凡纳滨对虾在加热过程中的ATP 关联化合物含量的变化规律,阐明贮藏期的凡纳滨对虾加热前后的感官质量与K值、G值和P值的相关关系,为虾类品质评价提供参考。
凡纳滨对虾购自广东省湛江市欢乐海洋水产部,平均体长(13.28±0.58)cm,平均体质量(25.10±0.62)g,鲜活对虾用海水在充氧条件下半小时内运回实验室,立即用冰水清洗,去头、壳,沥干表面水分后,部分进行鲜虾加热试验,将剩余虾用封口袋分成7 份,每份虾36 只,放入4 ℃冰箱冷藏。
试剂:ATP、ADP、AMP、IMP、HXR、HX标准品(纯度 > 98%)均购自上海源叶生物科技有限公司;磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钾均为分析纯,购自西陇科学股份有限公司(中国广东汕头市);高氯酸为分析纯,购自天津政成化学制品有限公司;甲醇为高效液相色谱(HPLC)级,购自赛默飞世尔科技。
主要仪器:Agilent 半制备1200 高效液相色谱仪,美国 Agilent 公司;TMS-G2-10-100ST-L 62Q0163 数显光纤温度探针,中国深圳欧普申光电科技有限公司。
将贮藏在4 ℃冰箱的凡纳滨对虾虾肉,按照贮藏期(1、2、3、4、5、6、7 d)分别取出,样品在加热之前,首先保证样品的初始温度保持在4 ℃,将光纤温度探针插入凡纳滨对虾虾仁的第二腹节中心位置,通过光纤温度传感器监测样品的中心温度,然后缓慢将带有温度探针的虾肉,放入75 ℃的数显恒温水浴锅,分别在达到40、45、50、55、60、65、70 和75 ℃时取出,同时用未加热样品作对照。
1.3.1 样品制备 参考RYDER 和AGUSTINI 等的方法[11-12],略有改动。将空白样品和加热过后的凡纳滨对虾虾肉用打浆机粉碎成糊状,称取虾肉(3个平行)2 g,加入10 mL 预冷在4 ℃体积分数10%的高氯酸溶液,用均质机充分均浆,再用5 mL 体积分数10%的高氯酸溶液清洗均质机转子两次,然后在10 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min,收集上清液,沉淀物再次加入10 mL 预冷体积分数的5%高氯酸溶液,用快速混均器使沉淀物混合均匀,浸提,离心,重复操作一次,合并上清液,用NaOH溶液中和并调pH 至6.5,用超纯水定容到50 mL,摇匀,取8 mL 样品放入-80 ℃备用,上机前放在冰水中解冻,再用0.22 μm 的微孔水相膜过滤,用于HPLC 进样分析。
1.3.2 ATP 关联化合物定量分析 色谱柱是COSMOSIL5C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm)色谱柱;流动相A 为CH3OH 溶液,B 为0.05 mol/L KH2PO4和0.05 mol/L K2HPO4混合溶液,pH 调至6.5;C 为超纯水;将甲醇用0.22 μm 的有机相膜抽滤,水溶液和盐溶液用0.22 μm 的水相膜抽滤,并进行超声脱气;柱温:25 ℃;进样量10 μL;样品运行程序:采用等度洗脱,缓冲液为体积比为49∶1 的流动相B 和A,样品运行时间19 min,在波长254 nm 处进行检测。
计算ATP 关联化合物的浓度计算公式:
式中,X表示凡纳滨对虾样品中的核苷酸及其关联化合物的含量(μmol/g);C是六种核苷酸及其关联化合物的标准混合品浓度校准曲线(μg/mL);V是样品提取物的体积(mL);m是样品的质量(g);M是每个核苷酸及其关联化合物的相对分子质量。
1.3.3K值、G值和P值的计算 根据Shahidi 的方法计算K值、G值、P值[3]。
式中,b为ATP 或其关联化合物的质量摩尔浓度(μmol/g)。
采用Miao 等[13]方法并增加多种感官类别,用凡纳滨对虾感官评估的质量指标方法(Quality index method,QIM)评估对虾加热前后的感官质量(表1)。鲜度相同的凡纳滨对虾分为两部分,一部分保持生料,另一部分使虾肉中心温度达到75 ℃[14]。由6 名已通过味道/气味识别和基础味觉测试的成员分别进行感官评估。通过所有感官类别的QIM 得分,获得质量指标(Quality index,QI)值。QI 值为0,凡纳滨对虾质量最佳;QI 值增加,凡纳滨对虾品质变差。
表1 贮藏期间的凡纳滨对虾加热前后的感官质量评分Table 1 Sensory quality scores of Litopenaeus vannamei before and after heating during different storage periods
每个样品平行处理3 次,数据处理和表格由WPS Office 2019 处理,结果以平均值±标准偏差表示。使用JMP 拟合分析(最小二乘均值差值Tukey HSD)进行显著性分析,P< 0.05 表示差异显著;图形处理由Origin2017 进行。
图1 可见,6 种ATP 关联化合物在30 min 内可有效分离,经单标和混标定性分析,峰保留时间在6.4 min 左右为IMP,7.6 min 左右为ATP,9.1 min左右为ADP,11.1 min 左右为HX,13.9 min 左右为AMP,25.9 min 左右为HXR。可见,该检测方法可节约时间和成本,重现性良好,流动相配置简便,采用等度洗脱充分保护柱子固定相;操作简便,效率高。
如表2 所示,六种核苷酸标准品在2~ 125 μg/mL 时呈现良好的线性关系,R2均在0.999 5 以上,检出限(LOD)为0.06~ 0.12 μmol/L,定量限(LOQ)为0.26~ 0.38 μmol/L。方程中,y,峰面积;x,样品浓度。
图1 六种核苷酸相关化合物标准品的高效液相色谱Fig.1 HPLC analysis of six nucleotile-related compound standards
表2 六种核苷酸及其关联化合物的标准曲线Table 2 Standard curve of six ATP-related compounds
由图2a 可见,凡纳滨对虾在4 ℃下贮藏时,随着贮藏时间的增加,ATP 含量降低;对虾中的ATP含量在贮藏期随着加热温度的上升呈现下降趋势。凡纳滨对虾生虾的 ATP 质量摩尔浓度为 0.30 μmol/g,当加热温度75 ℃时,ATP 质量摩尔浓度降至0.06 μmol/g,仅为生虾的20%。贮藏5 d 组的生虾ATP 消耗殆尽,当加热到40 ℃时,ATP 已检测不到;贮藏6~ 7 d 组,生虾ATP 已检测不到。虾类水产品中ATP 下降可能与体内高活性的ATP酶有关[15]。在加热过程中ATP 含量降低,可能由加热而引发的热降解所致。由于贮藏期不同,当加热到终点温度(75 ℃)时,ATP 降解率也不同:贮藏0~ 1 d 组ATP 降解80%左右,贮藏2~ 3 d 组降解65%左右,5~ 7 d 组降解100%。
图2b 可见,生虾在贮藏期间ADP 含量呈下降趋势,贮藏1 d 时降解较快,贮藏2~ 7 d 时ADP含量缓慢下降。生虾随着加热温度的增加,ADP 含量呈先增后降趋势。生虾加热到40 ℃,ADP 质量摩尔浓度为1.17 μmol/g,随着加热温度的升高,ADP 含量开始缓慢降低,在75 ℃时为0.47 μmol/g;贮藏1~ 5 d,加热至40 ℃时,ADP 含量变化无统计学意义(P> 0.05),至45~ 75 ℃时降低。贮藏6~ 7 d,随着加热温度升高,ADP 含量下降。可能与ATP 含量在贮藏6~ 7 d 时耗尽有关。生虾加热到75 ℃时ADP 降解51.13%,贮藏4 d,加热到75 ℃时ADP 降解39.13%,贮藏7 d 降解92.63%。贮藏期间的凡纳滨对虾加热前后ADP 的降解趋势与ATP 的变化趋势相似。
图2 贮藏时间对凡纳滨对虾加热过程中ATP 和ADP 含量的影响Fig.2 Changes of ATP and ADP contents in the heating process of Litopenaeus vannamei under different storage periods
图3 可见,凡纳滨对虾生虾随着贮藏时间的增加,AMP 含量不断降低,可能由AMP 脱氨酶分解所致[16]。凡纳滨对虾生虾中的AMP 含量在不同贮藏期加热过程中,随着加热温度的增加而增加,可能是由ATP 和ADP 的降解生成AMP,加之AMP酶在40 ℃以上时易失活,AMP 降解减少,同时水分含量降低,使AMP 含量上升。凡纳滨对虾生虾AMP 质量摩尔浓度为6.30 μmol/g,加热至75 ℃时升至9.51 μmol/g,是生虾的1.51 倍。生虾贮藏7 d后,仅为1.89 μmol/g,加热到75 ℃时,AMP 质量摩尔浓度为3.65 μmol/g。凡纳滨对虾加热到75 ℃时,不同贮藏时间组的AMP 增加:生虾和贮藏1~2 d,凡纳滨对虾加热到75℃时AMP 增加55%左右;贮藏3 d,AMP 增加91.90%;贮藏4~ 6 d,增加63%左右;贮藏7 d,增加92.89%。将刀额新对虾(Metapenaeus ensis)蒸至75 ℃时AMP 含量显著高于生虾[10],与本研究结果一致。
图3 可见,凡纳滨对虾生虾的IMP 含量随着贮藏时间的增加呈先增后降趋势。贮藏1~ 5 d,IMP随着加热温度的增加呈先增后降趋势;贮藏6~ 7 d,随着加热温度的增加而降低,其原因可能是因为ATP 和ADP 在贮藏期间消耗完全和AMP 含量不断降低,导致IMP 含量降低。凡纳滨对虾生虾的IMP质量摩尔浓度为3.78 μmol/g,加热到40 ℃时为4.65 μmol/g,75℃时为2.01 μmol/g,从40 ℃至75 ℃,IMP 降解56.77%;贮藏2 d,IMP 质量摩尔浓度为4.92 μmol/g,加热到40℃时达到最大值,质量摩尔浓度为5.56 μmol/g,75 ℃时为2.8 μmol/g,从40 ℃至75 ℃,IMP 降解49.64%;生虾贮藏6 d,IMP质量摩尔浓度为2.44 μmol/g,加热到40 ℃时为2.34 μmol/g,75 ℃时为0.99 μmol/g(降解59.42%);贮藏7 d,IMP 质量摩尔浓度为1.99 μmol/g,加热到40 ℃时为1.89 μmol/g,75 ℃时为0.82 μmol/g(降解58.79%)。
图3 贮藏时间对凡纳滨对虾加热过程中AMP 和IMP 含量的影响Fig.3 Changes of AMP and IMP in the heating process of Litopenaeus vannamei under different storage periods
图4 表明,凡纳滨对虾生虾的HXR 和HX 随着贮藏时间的增加而增加;不同贮藏期的凡纳滨对虾生虾中的HX 和HXR 在加热过程中总体上呈降低趋势,可能是将热降解的缘故。生虾的HXR和HX 分别为0.49、0.26 μmol/g,加热到40 ℃时分别为0.54、0.31 μmol/g,加热到75 ℃时分别为0.21、0.08 μmol/g;生虾在贮藏7 d 后分别达到1.57、1.79 μmol/g,加热到75 ℃时分别为1.21、1.00 μmol/g。生虾和贮藏1、2 d 的凡纳滨对虾加热到75 ℃时,HXR 和HX 降解50%左右,贮藏3~ 5 d 后降解25%左右,随贮藏时间的增加而降解速率降低。贠三月等[7]比较凡纳滨对虾生熟虾肉时发现,熟虾肉HXR 和HX 含量显著低于生虾肉,与本研究结果一致。
综上,ATP 关联化合物的变化与贮藏时间和加热温度密切联系,且贮藏时间直接影响加热过程中的ATP 关联化合物的降解规律;ATP 关联化合物的降解或生成率随着贮藏时间而变化;从呈味核苷酸角度分析,随着贮藏时间的增加,鲜味成分(IMP)先增后降,甜味成分(AMP)不断降低,苦味成分(HXR 和HX)呈不断增加趋势,随着加热温度的增加,鲜味成分先增后降,甜味成分呈增加趋势,苦味成分略有下降。
图4 贮藏时间对凡纳滨对虾加热过程中HXR 和HX 含量的影响Fig.4 Changes of HXR and HX contents in the heating process of Litopenaeus vannamei during different storage periods
表3 可见,随着贮藏时间的增加,凡纳滨对虾加热前后的QI 值均显著增加(P< 0.05),说明随贮藏时间的增加,生虾鲜度降低,加热后感官质量下降。生虾气味和颜色在贮藏期有显著性变化(P<0.05),不论生虾还是加热后,感官指标在贮藏2 d时均发生显著性变化(P< 0.05)。贮藏3 d 时,生虾出现腥味和异腥味的痕迹,颜色已显暗黑色。在贮藏4~ 7 d 后,变质严重,气味更加难以接受。生虾在3 d 不可接受,但加热过后,勉强可接受。但贮藏4~ 7 d 再加热的虾,感官不可接受。通过对感官质量评定,生虾在贮藏2 d 时QI 值为6.63,达到感官质量的最大可接受限值,贮藏3 d 再加热QI 值为9.79,达到感官质量的最大可接受限值,表明贮藏期间凡纳滨对虾加热后的质量与生虾鲜度密切相关。
表3 用QIM 对贮藏期凡纳滨对虾的感官评定Table 3 Sensory evaluation of Litopenaeus vannamei in different storage periods by QIM
表3 续(Continued)
如图5 所示,随着贮藏时间的增加,生虾的K值呈线性增加趋势,说明凡纳滨对虾的鲜度不断降低。加热后凡纳滨对虾K值也呈线性增加趋势,加热后凡纳滨对虾的K值低于生虾。生虾和加热后虾,在贮藏0 d 时K值分别为6.19%、2.35%,贮藏2 d时K值分别为11.62%、7.26%,贮藏4 d 时分别为20.28%、15.97%,贮藏7 d 时分别为45.84%、33.02%。从呈味角度看不同贮藏时间对虾加热后的K值:K值上升,说明随着贮藏时间的增加苦味物质占ATP 关联化合物总量比例增加;而加热后的K值低于生虾,说明加热使生虾中的苦味物质减少,从而苦味物质占ATP 关联化合物总量比例减少。根据感官质量分析,贮藏2 d 的QI 值为生虾的最大可接受限值,贮藏3~ 4 d 的QI 值为加热后对虾的最大可接受限值,因此,生虾和加热后的虾K值最大可接受上限分别为11.62%和11.87%。
图5 可见,生虾K值和贮藏时间的线性回归方程决定系数为0.934 6,加热后对虾K值和贮藏时间的线性回归方程决定系数为0.962 1,表明生虾和加热后对虾的贮藏时间与K值具有较好相关性,K分别可评估生虾的鲜度和加热后虾的品质,当凡纳滨对虾鲜度下降时,烹饪后对虾的质量也降低。贮藏期间的K值与生熟鱼虾品质密切关联。Takashi 等[17]分析生鱼肉与蒸煮鱼肉K值的线性回归值时,发现蒸干鱼制品K值反映了原材料的鲜度和品质。戚晓玉等[18]研究表明,日本沼虾(Macrobranchium nipponense)在贮藏期间K值的变化趋势与TVB-N的变化趋势基本相似,K值变化与贮藏时间有较高的线性关系,K值作为日本沼虾鲜度的指标较TVB-N 更为合适。可见,K值可作为评估对虾鲜度的指标。
图5 贮藏期内凡纳滨对虾加热前后K 值的变化Fig.5 Changes of K value before and after heating of Litopenaeus vannamei under different storage periods
由图6 可知,随着贮藏时间的增加,凡纳滨对虾生虾的G值呈线性增长趋势,加热后对虾的G值也呈线性增长趋势。加热后对虾的G值低于生虾。生虾和加热后对虾G值分别为7.09%、2.48%,贮藏7 d 时分别为59.38%、39.04%。从呈味角度看,加热后对虾苦味物质(HX 和HXR)的减少和甜味物质(AMP)增加,造成加热后G值低于生虾。由于贮藏时间增加,苦味物质增加,造成加热后对虾G值的增加。贮藏2 d 时QI 值为生虾感官最大可接受限值,贮藏3~ 4 d 时QI 值为加热后对虾的感官最大可接受限值,生虾和加热后对虾的G值最大可接受上限分别为12.69%和12.84%。
生虾的G值与贮藏时间的线性回归方程的决定系数为0.875 9,相关系数较低,不适合作为凡纳滨对虾生虾的鲜度指标。Mohan 等[19]研究发现,鱼肉的鲜度指标G值与贮藏时间的线性回归方程决定系数低于0.90,不适合作为鲜度指标,与本文结果一致。但加热后对虾的G值和贮藏时间线性回归方程的决定系数为0.953 5,相关性较佳,可作为评估虾肉鲜度的指标。
图6 贮藏期内凡纳滨对虾加热前后G 值的变化Fig.6 Changes of G value of Litopenaeus vannamei before and after heating in different storage periods
由图7 可知,随着贮藏时间的增加,凡纳滨对虾生虾P值呈线性增长趋势,加热后对虾P值也呈线性增长趋势。加热后对虾P值低于生虾。生虾和加热后对虾贮藏0 d 时P值分别为6.92%、2.46%,7 d 时分别为46.46%、33.18%。从呈味角度看,加热后对虾P值是苦味物质与呈味物质的比值。加热后对虾苦味物质减少,甜味物质增加,造成加热后对虾P值低于生虾。由于贮藏时间的增加,苦味物质也不断增加,造成加热后P值增加。贮藏2 d 时QI 值为生虾的最大可接受限值,贮藏3~ 4 d 时加热后对虾QI 值为最大可接受限值,生虾和加热后对虾P值最大可接受上限分别为12.02%和12.09%。
生虾P值和贮藏时间的线性回归方程决定系数为0.924 4,加热后对虾P值和贮藏时间的线性回归方程决定系数为0.976 4,相关性均较佳,P值分别可评估生虾鲜度和加热后对虾的品质。
随着贮藏时间的增加,生虾的K值、G值和P值呈线性增长趋势,导致加热后对虾的K值、G值和P值也呈线性增长趋势,这在鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)[20]、欧洲鳗鱼(European eel)[21]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[22]亦有类似结果。当表征生虾鲜度的K值、P值增加时,生虾鲜度降低,从而导致烹饪后的虾的品质下降。这可能主要归因于IMP 的快速减少和HX 的增加。
图7 贮藏期内凡纳滨对虾加热前后P 值的变化Fig.7 Changes of P value of Litopenaeus vannamei before and after heating in different storage periods
由图8 可知,随着生虾感官质量评分QI 值的增加,生虾的K值、G值和P值也呈上升趋势;其与QI 值分别呈直线关系,线性回归方程的决定系数分别为0.934 6、0.876 0、0.924 4。其中G值的线性回归方程的决定系数较低,不适于表征生虾的感官质量。K值和P值可用来评估生虾的感官质量。
由图8 可知,加热后对虾K值、G值、P值随感官质量评分QI值的增加而增加。加热后对虾K值、G值和P值与QI 值的线性回归方程决定系数分别为0.921 0、0.907 5、0.944 8,因此,加热后凡纳滨对虾的K值、G值和P值可用来评估其感官质量。
图8 生虾及加热后凡纳滨对虾K 值、G 值和P 值与QI 值的相关性分析Fig.8 Correlation analysis of K value,G value and P value with QI value in different storage periods of raw and heated Litopenaeus vannamei
本研究表明,随着贮藏时间的增加,ATP、ADP和AMP 下降;IMP 先上升后下降;HX 和HXR 上升。随着加热温度的增加,ATP 和ADP 下降,AMP增长,IMP、HX 和HXR 先增加后降低;ATP 关联化合物的变化与贮藏时间和加热温度密切联系,且贮藏时间直接影响凡纳滨对虾生虾加热过程中ATP关联化合物的降解规律;ATP 关联化合物的降解或生成随着贮藏时间而变化。生虾贮藏2 d 时达到最大可接受上限,贮藏3 d 时加热对虾达到最大可接受上限。G值不适宜作为生虾鲜度指标,K值和P值可评估生虾的鲜度,K值、G值、P值可评估加热后对虾的品质,当生虾鲜度降低时,烹饪后的纳滨对虾品质也随之降低。K值、P值可用来表征贮藏期生虾的感官质量;K值、G值、P值可表征贮藏虾加热后的感官质量。