高效液相色谱法测定花蛤中扑草净残留量

田亚亚，刘敏轩，杨茜，亢春雨，王向红*

河北农业大学食品科技学院（保定 071000）

扑草净是一种抑制植物光合作用的选择性内吸收传导型的含氮除草剂，用于田地的除草效果很好[1]，却被一些不法商家用于水产养殖行业，用来清除养殖水体中的水草及有害藻类，导致扑草净在水产品中累积残留，如鱼、虾、贝、蟹、海参等水产品，最终可能通过食物链直接损害人类健康[2-3]。

图1 扑草净的结构式

目前，中国对蔬菜、水果、粮食中扑草净残留的测定方法有明确的国家标准，且对水、土壤中扑草净的测定方法报道较多，但对水产品中扑草净残留检测研究得比较少，故中国尚无相对完善的检测水产品中扑草净残留量的标准方法。因此，建立水产品中扑草净残留量的快速检测技术迫在眉睫。食品（主要为植物性食品）中扑草净残留量的检测方法有气相色谱法（FID检测器）[4]、气相色谱-质谱法[5]、液相色谱法[6-7]、液相色谱-串联质谱法[8]，其中分析水产贝类中的扑草净残留量的检测方法有液相色谱-串联质谱法[9]。

试验采用高效液相色谱法测定水产品——花蛤中扑草净的残留量。该方法操作简便、快速灵敏、准确可靠。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Waters 1525高效液相色谱仪；SunFireTMC18柱（4.6 mm×150 mm×5 μ m）；RE-52 A型旋转蒸发仪（西安安泰仪器有限公司）；KQ-500 DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HJ-2 B恒温磁力搅拌器（金坛市医疗仪器厂）；十万分之一电子天平（托利多上海有限公司）；烧杯；量筒；漏斗；容量瓶。

1.2 试剂

扑草净（国家标准物质研究中心研制，纯度99.9%）；70%甲醇、纯甲醇（色谱纯，迈瑞达公司）；二氯甲烷（分析纯，天津市进丰化工有限公司）；正己烷（色谱纯，天津市福晨化学试剂厂）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）；无水硫酸钠（化学纯，天津市天力化学试剂有限公司）；C18小柱（500 mg/3 mL）；氨基小柱（500 mg/3 mL）；石墨化碳黑小柱（500 mg/3 mL）；氧化铝（酸性）小柱（500 mg/3 mL）；PSA小柱（N-丙基乙二氨键合硅胶固相萃取小柱，500 mg/3 mL）。

1.3 色谱条件

色谱柱，SunFireTMC18柱（4.6 mm×150 mm×5 μ m）；流动相，甲醇-水（70︰30，V/V）；紫外波长230 nm；流速1 mL/min；柱温25 ℃；进样体积10 μL。

1.4 溶液配制

1.4.1 标准储备液的配制

准确称取50 mg扑草净标准品至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，制得1.0 mg/mL标准贮备液。

1.4.2 供试品溶液的配制（样品前处理）

提取：称取10 g已粉碎均质的样品于烧杯中，每次加入30 mL丙酮，于振荡器上振荡10 min，静置分层后，收集滤液于锥形瓶中，重复3次。在滤液中加入5 g氯化钠，振荡15 min，静置分层，弃去水层，丙酮层过无水硫酸钠后，收集于烧杯中，用10 mL的丙酮洗涤锥形瓶，过滤到烧杯中，用氮吹浓缩仪于50 ℃浓缩至干，加3 mL丙酮溶解残渣。

净化：取固相萃取小柱，加入1柱管体积的正己烷对小柱活化。加入3 mL的样品处理液，并用2 mL×2的丙酮洗涤鸡心瓶，并将洗涤液转移到小柱中。用2 mL×2的二氯甲烷洗脱，收集洗脱液。

浓缩：收集洗脱液于烧杯中，用氮吹浓缩仪于40℃浓缩至干，用1 mL的甲醇定容。过0.22 μm有机滤膜，供液相分析。

2 结果与讨论

2.1 流动相配比的选择

考察甲醇-水90︰10，80︰20和70︰30（V/V）3种配比的混合溶液为流动相，其他色谱条件相同。结果发现，当流动相为甲醇-水90︰10时，扑草净保留时间为2.67 min，出峰时间太早，易受到其他杂质的干扰。当甲醇-水80︰20时，保留时间为4.08 min，分离效果不明显，峰形不好。当甲醇-水70︰30时，保留时间为7.94 min，分离效果、洗脱效果都很好，且色谱峰形好。故选择甲醇-水70︰30（V/V）作为流动相。扑草净标样液相色谱图见图2。

图2 扑草净标准溶液的液相色谱图

2.2 萃取条件的选择

2.2.1 固相萃取小柱的选择

花蛤中含有大量的蛋白、脂肪、碳水化合物等营养物质，这些物质会对试验结果产生较大影响，故在进行液相分析前需有效地去除这些杂质[10]。固相萃取作为最常用的样品净化方法之一，可满足液相对样品前处理的要求。试验选用PSA柱（N-丙基乙二氨键合硅胶固相萃取小柱）、C18柱、石墨化碳黑柱、氨基柱、氧化铝（酸性）柱5种不同固相萃取小柱进行试验。

以花蛤为样品，在扑草净添加浓度0.05 mg/kg条件下，比较不同固相萃取小柱的萃取效果。由图3可以看出，经PSA固相萃取小柱萃取后，得到的峰面积最大，说明PSA小柱中的吸附剂N-丙基乙二氨对扑草净的吸附能力很强。同时由表1中不同萃取小柱对回收率的影响也能得出由PSA小柱处理后得到的回收率为86.54%～89.21%，是5种不同萃取小柱中得到回收率最高的。PSA柱属于弱阴离子交换柱，吸附机制之一为极性作用和螯合作用[11]，故能很好地将扑草净吸附在表面。操作方法较为简单，能达到较好的净化效果，故选择PSA固相萃取小柱作为固相萃取的净化柱。

图3 不同固相萃取小柱对峰面积的影响

表1 不同固相萃取小柱对回收率的影响（N=6）

2.2.2 洗脱剂的选择

试验比较丙酮、甲醇、正己烷、二氯甲烷和乙腈对扑草净的洗脱效果。扑草净添加浓度0.05 mg/kg，使用PSA柱为萃取柱条件下，经萃取后，分别以这5种溶剂进行洗脱，测定洗脱液的峰面积。从图4可以看出，正己烷的洗脱效果最好。由表2同样可以得出，经正己烷洗脱后，回收率最高达94.58%，洗脱剂采用甲醇、乙腈时，回收率均小于60%。洗脱剂采用正己烷溶液时，由于其极性大于提取液，可将结合在PSA柱上的扑草净直接洗脱，操作简单，净化效果好。

图4 不同洗脱剂对峰面积的影响

表2 不同洗脱剂对回收率的影响（N=6）

图5 空白花蛤样品的液相色谱图

图6 加标花蛤样品的液相色谱图

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系

用甲醇稀释配置扑草净含量分别为1，10，40，80，100，200，600和1 000 μg/mL的标准溶液，进行测定。以标准样品的质量浓度（x）为横坐标，相应的峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线。得扑草净的标准曲线回归方程：y=6.3×104x+1.46×106，相关系数为R2=0.996 1。

图7 扑草净的标准曲线

2.3.2 回收率、精密度与检出限

由表3可以得出，在0.025～0.100 mg/kg范围内，扑草净回收率为76.13%～85.57%；相对标准偏差（N=6）为2.45%～7.74%。以基线噪声3倍峰面积对应的质量浓度确定扑草净的检出限，得出扑草净检出限为0.3 μg/kg。

表3 花蛤样品中扑草净的添加回收率与精密度（N=6）

3 结论

建立一种采用高效液相色谱法测定水产品——花蛤中扑草净残留量的分析方法。该方法对样品的前处理较为简单且净化结果良好，故可推广使用。结果表明，该方法的检出限为0.3 μg/kg，在0.025～0.100 mg/kg浓度范围内，扑草净回收率最高可达85.57%；相对标准偏差均小于10%。灵敏度、准确度、精密度、稳定性、方法的回收率均能满足农药残留分析要求，故可保证检测分析数据的可靠性，是一种较为理想的快速检测方法。