QuEChERS-LC-MS/MS法测定羊奶中红霉素的残留

张晓云，何秀玲，李培锋，毛伟，孙华，白玉廷*

1. 内蒙古农业大学兽医学院（呼和浩特 010018）；2. 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室（呼和浩特 010018）

红霉素（Erythromycin，ERM）属大环内酯类抗生素，分别是由红霉素A、B、C和D 4种结构密切相关的组分所组成的混合物，其中红霉素A是最重要的成分，其分子结构如图1所示，抗菌活性最强（是其它组分的约3～5倍），因而将红霉素A作为临床上最常用药物。红霉素主要具有抗革兰氏阳性细菌的作用，其机制是通过基因易位干扰微生物蛋白质合成。据记载[1-3]，红霉素在畜体内的药物表观分布容积（Vd）比较大，马静注12.5 mg/kg时，Vd为5 539 mL/kg；黄牛、水牛、猪静注8 mg/kg，其Vd分别为1 620.38，3 206.23和3 260.63 mL/kg；山羊静注8 mg/kg，Vd值为4 286.97 mL/kg，表明红霉素在体内分布很广，这与红霉素的血浆蛋白结合率很低有关。文献[3]记载红霉素的血浆蛋白结合率为18%～40%。因红霉素的碱性和高脂溶性的特性，导致其在组织中的浓度高于血清中浓度，这种影响在奶中更为明显，奶中红霉素水平在同一时间内相当于血清中水平的2倍。

测定动物源性食品中红霉素残留的方法主要有微生物抑制法[4]、薄层色谱（TLC）法[5]、液相色谱-二极管阵列检测（LC-DAD）法[6]、液相色谱-电喷雾（LC-CAD）法[7]和液相色谱-质谱（LC-MS/MS）法[8]。液相色谱-串联质谱法灵敏度高、精确度好，是检测红霉素残留的主要方法。农业部235号公告中规定牛/羊奶中红霉素的最高残留限量（MRL）为40 μg/kg，文献报道中关于牛奶中红霉素残留的测定，刘艳琴等[9]测定牛奶中红霉素残留量，前处理用乙腈提取样品，经ZORBAX Eclipse SB-C18（1.8 μm，3.0 mm×50 mm）分离，流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈（30︰70，V/V），采用电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测，结果显示，检测限为2.0 μg/L，定量限为5.0 μg/L，样品回收率为88.2%～92.0%，RSD为1.67%。郭春海等[10]测定牛奶中6种大环内酯类药物的残留量，乙腈提取样品，采用OasisHLB固相萃取柱净化提取液，过Agilent EclipseXDB-Pheny1苯基柱（5 μm，2.1 mm×150 mm），流动相为甲醇和0.1%乙酸水溶液，梯度洗脱，采用电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测，结果显示，检测限为1 μg/kg，方法回收率为81.5%～96.1%，RSD为3.29%～9.96%。García-mayor等[11]开发一种基质固相分散（MSPD）的提取方法，用于羊奶中红霉素及其他大环内酯类抗生素的残留分析。Juan等[12]开发一种加压液相萃取-LCMS/MS法测定牛奶和肉类中大环内酯类和林可酰胺类抗生素的残留方法。国内外对于牛奶的红霉素检测方法报道较多，但关于羊奶中红霉素残留的检测国内尚未有报道。

羊奶的营养价值高，是国内外一致强烈认同的最接近人奶的一种乳品，被国际营养学界誉为“奶中之王”，大量文献报道羊奶与牛奶相比的优点有：更容易被人体消化吸收、长期饮用不会导致发胖、美容养颜、抗过敏、增强抵抗力、预防心脑血管疾病、降低胆固醇[13-17]。随着羊奶产业化进程的发展和广大消费者对羊奶营养价值的认同，羊奶消费市场已初步形成。因此建立一种以解决中国当前乳和乳制品行业的残留问题成为当务之急[18-20]。试验建立的LC-MS/MS方法采用QuEChERS样品前处理包，80%乙腈水溶液提取，醋酸钠和MgSO4萃取，石墨炭黑和柠檬酸钠吸附净化。步骤简便、易操作且回收率较高，不需要耗费固相萃取柱，且不需要氮气浓缩，适合羊奶样品的定性与定量检测。该方法的建立能很好地分析羊奶中痕量水平的红霉素残留，大幅提高检测效率，为羊奶中红霉素残留的常规检测提供可靠方法。

图1 红霉素的分子结构

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

Agilent 6460高效液相色谱串联质谱仪（美国安捷伦公司）；色谱柱，CAPCELL PAK MGⅡ-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；离心机（≥15 000 r/min，Thermo）；分析天平（感量分别为0.000 1 g和梅特勒0.000 01 g，奥豪斯仪器有限公司）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；乙腈（Sigma公司）；氨水（分析纯）；QuEChERS样品前处理包（型号PQS-1）；试验用水符合GB/T 6682规定一级水要求；标准品：红霉素（纯度大于99%，CAS 59319-72-1，Sigma公司）；罗红霉素（纯度≥90%，CAS 80214-83-1，Sigma公司）；羊奶（无红霉素残留）。

1.2 方法与结果

1.2.1 样品处理

制样：称取5 g（精确到0.000 1 g）羊奶样品于50 mL萃取管（氯化钠+醋酸钠）中，分别添加乙腈配制的红霉素标准品溶液使其为0，20，40，80，200，400和800 ng/g（经处理，上样浓度分别为0，5，10，20，50，100和200 μg/kg）和乙腈配制浓度50 μg/kg（200 ng/g）的罗红霉素溶液。

萃取：向萃取管中加入20 mL 80%乙腈水溶液，涡旋振荡2 min，将盐包（无水MgSO4+醋酸钠）打开，将盐全部加入萃取管中，涡旋振荡2 min，以5 000 r/min离心5 min。

净化：准确移取5 mL上清液于净化管（石墨炭黑和柠檬酸钠）中，涡旋混匀1 min，以5 000 r/min离心3 min，吸取1 mL过滤膜，待LC-MS/MS测定。

1.2.2 标准品溶液和内标溶液的配制

称取约1.00 mg（0.001 00 g）红霉素标准品于1.5 mL EP管中，精密称定。加入相当量乙腈溶解，配制成1.00 mg/mL标准储备液。称取约1.00 mg（0.001 00 g）罗红霉素标准品于1.5 mL EP管中，精密称定。加入相当量乙腈溶解，配制成1.00 mg/mL标准储备液，于4 ℃保存。

1.2.3 LC-MS/MS色谱与质谱条件及其优化

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱，CAPCELL PAK MGⅡ-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相，乙腈-0.5%氨水（92︰8），流速0.8 mL/min，等度洗脱，运行时间8.5 min；柱温30 ℃；进样量5 μ L；参考出峰时间红霉素3.608 min，内标物质出峰时间4.946 min。

1.2.3.2 质谱条件

离子源，电喷雾离子源；扫描方式，正离子扫描；检测方式，多反应监测；电喷雾电压4 000 V；离子传输毛细管温度350 ℃；源内碰撞诱导解离电压7 V；雾化器流速8 L/min。

红霉素属于弱碱性化合物（含N原子），分子量大，适合用较大质量适用范围的ESI离子源，故选择MRM正离子模式采集数据。将0.5 mg/L红霉素标准溶液进行全扫描，在正离子扫描下，特征离子峰（m/z=734.4）丰度最高作为红霉素的母离子，进行二级质谱裂解后，优化碰撞气能量及去簇电压，将其734.4/576.3和734.4/158.1分别作为红霉素定性离子对，将734.4/158.1作为红霉素定量离子对，如图2所示。

图2 红霉素的子离子扫描图

1.2.4 线性范围与线性方程

在该方法所确立的试验条件下，精确称定约5 g羊奶样品，按照1.2.1小节的方法配制的红霉素溶液，和罗红霉素溶液添加到空白羊奶样品中进行液质联用测定，以红霉素/罗红霉素的响应峰面积（Y轴）对相应的质量浓度（X轴，μ g/kg）作图。

1.2.5 方法灵敏度

方法的灵敏度指该方法对单位浓度或单位量的待测物质的变化所引起的响应量变化的程度，可用仪器的响应值与对应的待测物质的浓度或量之比描述。

1.2.6 方法的准确度与精密度考察

采用标准添加法，在空白羊奶中添加3个不同浓度（10，50和200 μg/kg）红霉素，50 μg/kg罗红霉素进行回收率试验，每个浓度进行5次重复测定。记录红霉素峰面积（C1）与内标罗红霉素峰面积（C2），把C1/C2的比值代入标准曲线，计算出药物浓度S1，并与实际加入标准浓度值S2进行比较，计算相对回收率。各浓度在1 d内测6次；每一浓度隔天测定1次，连续测定6次，计算日内、日间RSD。

1.2.7 稳定性试验

取质量浓度分别为10，50和200 μ g/kg的羊奶样品进行色谱分析，每个浓度平行测3次，分别考察其在4℃，室温和-20 ℃下保存1周的稳定性。

1.2.8 空白试验

除不加标准品外，采用完全相同的步骤进行平行操作。

1.2.9 重复性试验

按1.2.1小节的方法制成红霉素上样浓度分别为5，10，20，50，100和200 μ g/kg，罗红霉素标准工作液浓度为50 μg/kg加入到空白羊奶中进行上述色谱及质谱分析，以内标法计算含量，每个浓度重复6个样。

1.3 数据处理

数据应用 SPSS 17.0软件对试验结果进行统计学分析，试验数据用表示。

2 方法学考察

2.1 线性范围与线性方程

以0，5，10，20，50，100和200 μg/kg空白羊奶中红霉素浓度为横坐标，以LC-MS/MS检测出的红霉素峰面积与内标罗红霉素的峰面积比值为纵坐标，做线性回归。定量离子对的响应峰面积和样品浓度之间有良好的线性关系，其回归方程为y=0.021 5x-0.034 7，r2=0.999 8，检测范围为0～200 μ g/kg。详见图3。

2.2 方法灵敏度

选取一系列较低质量浓度的红霉素标准工作溶液，按该方法进行分析检测，计算LOD和LOQ。采用乙腈配制标准曲线，将红霉素药物的LOD定为5 μg/kg（S/N＞3），LOQ定为20 μg/kg（S/N＞20，RSD＜10%）。

2.3 方法的准确度

回收率测定结果见表1。回收率符合LC-MS/MS检测要求，可用于测定羊奶中红霉素浓度。

图3 羊奶样品标准曲线

表1 不同添加浓度下羊奶样品中红霉素的回收率（n=5）

2.4 精密度考察

测定所建立检测方法的日内精密度与日间精密度，结果见表2。高、中、低3个质量浓度的日内精密度相对标准偏差均小于3%，日间精密度相对标准偏差均小于10%，均符合LC-MS/MS检测要求。

表2 检测羊奶样品中红霉素方法的精密度（，n=6）

表2 检测羊奶样品中红霉素方法的精密度（，n=6）

浓度/(μ g·kg-1)(μ g·kg-1) RSD/% 测定值/(μ g·kg-1) RSD/%日内精密度 日间精密度测定值/10 9.13±0.17 1.9 10.66±1.05 9.8 50 50.68±1.21 2.4 48.71±4.28 8.8 200 200.95±5.68 2.8 199.62±16.97 8.5

2.5 稳定性试验

结果表明，在4 ℃，室温和-20 ℃下保存1周，结果均稳定（RSD＜7%）。

表3 不同温度条件下红霉素在羊奶中的稳定性研究结果（，n=3）

表3 不同温度条件下红霉素在羊奶中的稳定性研究结果（，n=3）

% -20 ℃ RSD/%10 13.51±0.90 6.7 10.88±0.47 4.3 11.51±0.17 1.5 50 45.69±2.92 6.4 48.93±1.09 2.2 48.26±0.46 1.0 200 201.36±2.72 1.4 200.39±3.97 2.0 200.91±5.13 2.6(μ g·kg-1) 4 ℃ RSD/浓度/% 室温 RSD/

2.6 空白试验与专属性考察

在建立的LC-MS/MS检测条件下的0～6.4 min内无干扰峰出现，基线平稳（图4B）。羊奶空白样品中加入红霉素和罗红霉素，在该色谱条件下保留时间分别为3.608和4.946 min，色谱峰之间无干扰，分离度为1.87分，离效果良好；红霉素的拖尾因子为0.8，罗红霉素的拖尾因子为1.3，在确定的色谱条件下虽有拖尾（前延），但均在规定范围内（不超过1.5），不影响峰面积的准确测量（图4A）。

图4 色谱图

2.7 重复性试验结果

试验显示，羊奶空白样品中红霉素的平均含量分别为5.5，9.69，19.18，48.81，99.55和200.53 μ g/kg，RSD分别为4.41%，1.26%，0.57%，1.29%，1.48%和3.99%，表明该方法重复性好。

3 讨论

3.1 流动相的选择

流动相中只有加入NH4OH红霉素和罗红霉素才能完整出峰，质谱测定只能用3种盐：甲酸铵、乙酸铵、氨水，其中乙酸铵和甲酸铵对于峰形改变不大；对于氨水浓度的选择，试验比较1.5%，0.5%和0.2% 3种不同浓度氨水，试验证实选择1.5%氨水溶液时，氨水浓度太大，易与空气中的CO2结合，形成(NH4)2·CO3沉淀，大批量样品测定时，会与流动相中乙腈相结合造成色谱柱堵塞；选择0.2%氨水溶液时，色谱图中红霉素与罗红霉素可分离，峰低矮圆润，峰形对称不完全，拖尾较严重，保留时间延后；在0.5%氨水溶液情况下，红霉素与罗红霉素分离完全，峰形对称且尖锐，拖尾因子在规定范围内。故最终确定采用0.5%氨水溶液-乙腈作为流动相等度洗脱。

3.2 前处理方法的选择

红霉素残留检测的前处理方法主要有传统液液萃取、固相萃取和分子印迹固相萃取等，但这些方法存在试剂量消耗大、操作步骤繁琐、需使用特殊设备或需要特定的试验环境等问题。对比其他处理方法，QuEChERS方法的优势有：回收率高；准确度和精密度高，可用内标法进行校正；分析速度快，能在20 min内完成6个样品的处理；溶剂使用量少，污染小，价格较低且不使用含氯化物溶剂；操作简便，无需良好训练和较高技能就可很好完成，可控性强；样品制备过程中不使用玻璃器皿，装置简单。QuEChERS方法是一种快速、简单、便宜、高效、耐用和安全的新兴提取净化技术，利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化目的，为解决上述问题提供了新方法。

4 结论

采用QuEChERS提取净化方法，并结合高效液相色谱串联质谱定量分析高灵敏度的优势，建立QuEC-hERS-高效液相色谱串联质谱法测定羊奶中的红霉素残留的方法。采用电喷雾离子源ESI，正离子扫描，选择MRM多反应监测，流动相为乙腈-氨水等度洗脱等色谱和质谱条件，经0.22 μm有机针孔滤膜过滤，采用罗红霉素做内标。在5～200 μ g/kg的范围内线性关系良好，日内精密度＜2%，日间精密度＜10%，方法的检测限（LOD）为5 μg/kg，根据农业部235号公告中规定红霉素在羊奶中的MRL为40 μg/kg，以此MRL的1/2（20 μg/kg）作为红霉素的定量限（LOQ）。在10，50和200 μg/kg的添加水平下，羊奶回收率为96.9%～100.3%，日内精密度为1.9%～2.8%，日间精密度为8.5%～9.8%，特异性均符合LC-MS/MS检测要求，因此试验建立的方法准确、可靠，为乳制品中羊奶红霉素残留的定性和定量检测提供依据。