哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂降低肾移植受者人巨细胞病毒感染的研究进展

张 帆，邢益平

(南京医科大学，江苏 南京 210029)

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是β疱疹病毒家族成员之一，该家族中还包含人疱疹病毒6、7，以及许多动物巨细胞病毒。HCMV DNA基因组大小约为230 kb,是目前人类病毒中最大的[1]。HCMV DNA基因组由其独特的长序列(UL)和短序列(US)两部分组成，每一部分都是反向重复序列[2]。HCMV是感染人类的八大疱疹病毒之一，常感染免疫力低下者，尤其是移植术后患者、晚期艾滋病患者以及新生儿[1]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin ，mTOR)是酸肌醇-3-激酶(PI3K)家族下游的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)，该激酶可影响HCMV感染的所有阶段[3]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂(mTORi)作为免疫抑制剂用于肾移植术后患者，可降低HCMV感染事件[4-8]。本文就mTORi降低肾移植受者HCMV感染的研究进展进行综述。

1 HCMV感染

HCMV一个重要的生物学特性是导致宿主终身潜伏感染，一旦HCMV被激活，可以再次发病[1]。HCMV潜伏感染的机制可能与主要早期即刻蛋白(major immediate-early protein，MIEP)的表达相关。MIEP可反作用于宿主细胞基因，通过调控宿主细胞基因表达水平，进而改变宿主细胞的生理状态，从而促进病毒的增殖。HCMV感染的三个阶段皆调控磷脂酰肌醇-3-激酶(acid-inositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase，AKT/PKB)/mTOR通路[2]，如在感染成纤维细胞早期，PI3K/AKT/mTOR通路在血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和或整合素参与介导下早期瞬时激活，而持续性激活则依赖于病毒的MIEP IE72和IE86[9]。PI3K的早期激活是病毒进入宿主所必需的，而后期的持续性激活则是病毒基因表达和复制的重要保障。

2 肾移植术后HCMV感染现状

尽管已有许多预防和治疗策略，免疫抑制状态下器官移植者HCMV感染仍然是一个严重的问题。除了费用增加，发病率和病死率增高外，HCMV感染也可能与急性排斥反应，减弱移植物功能和降低长期生存率有关。在未预防性使用抗病毒药物的情况下，10%～20%的肾移植术后患者会出现症状性HCMV感染，高达50%的患者表现为无明显症状的病毒激活状态。尽管使用缬更昔洛韦或更昔洛韦可有效预防HCMV感染，但迟发性HCMV感染还是会发生在预防性抗病毒之后[10-11]。Helanterä等[10]报道，预防性使用抗病毒药物3个月，停药后18%～31%的肾移植患者出现迟发性HCMV感染。有证据表明移植术后抗病毒达6个月可降低迟发性HCMV感染发生率，但Helanterä等[10]研究发现，预防性使用缬更昔洛韦长达6个月，仍有48%的患者出现迟发性HCMV感染；Arthurs等[11]研究也提及，预防性使用抗病毒药物92 d后仍有迟发性HCMV感染的可能。因此，目前的抗病毒药物不足以满足人们的需求，鉴于HCMV独特的生命周期，必须考虑新的抗病毒方案。

3mTOR

mTOR是PI3K家族下游AKT，是参与细胞内多个信号通路的重要物质，影响细胞的生长、增殖、代谢、自噬、血管生成等诸多重要过程[9]。mTORi进入细胞后，在胞浆内与FK结合蛋白12(FK binding protein-12，FKBP-12)结合形成复合物，进而与 mTOR 结合，抑制mTOR活性，使p70S6 激酶脱磷酸化而失活，从而抑制蛋白质的合成及细胞周期循环[12]。因此，mTORi可抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖、分化及抗体的形成，同时也可抑制非免疫细胞(成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞和平滑肌细胞)的增殖[13]。mTOR的组成和功能如下。

3.1 mTORC1 mTORC1的主要功能是通过调节蛋白质翻译，以控制蛋白质合成。在胞内营养不足时，mTORC1被腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)以结节性硬化复合物 (tuberous sclerosis complex, TSC)相关抑癌基因抑制[14]。当营养充足时，AMPK不被激活，AKT磷酸化并抑制TSC，导致mTORC1活化并提高蛋白翻译[15]。mTORC1通过使eIF4F复合物和S6激酶磷酸化调节起始翻译。eIF4E通常以低磷酸化状态与eIF4E结合蛋白1(4E-BP1)结合，从而阻止翻译起始复合物形成[16]。mTORC1磷酸化4E-BP1，降低其与eIF4E的亲和力，允许eIF4F复合物的形成，并通过促进核糖体向5’端移动以增加翻译量。eIF4F水平与细胞内蛋白质合成水平直接相关。S6K磷酸化会激活其他翻译因子，从而增加翻译扫描，抑制蛋白翻译抑制剂，并刺激氨基酸添加到新生肽链中[16]。总之，在生长因子或营养充足情况下，mTORC1是蛋白翻译的主要调控因子。

3.2 mTORC2 关于mTORC2的研究资料较少，推测mTORC2主要在磷酸化和激活AKT中起重要作用。

4 mTOR通路在HCMV感染中作用

mTOR通路在HCMV感染中起重要作用。通常，在细胞应激阶段，如在HCMV感染时mTOR活性降低。AMPK作为mTOR抑制剂，在HCMV感染时上调，但在被感染细胞中，这种关系似乎并不相关[17]。HCMV多功能蛋白UL38(protein UL38)与TSC1/2结合，通过破坏AMPK的负调节作用激活mTORC1。因此，在HCMV感染后通过提高磷酸化水平和增加eIF4E蛋白量来促进相关病毒复制蛋白质的翻译[18]。阻断eIF4F复合物形成，可减少病毒复制，支持mTOR激活在HCMV感染复制阶段具有重要作用。

mTOR在HCMV感染潜伏期的作用目前知之甚少。既往发现mTOR可以使一种转录辅助抑制因子(KRAB-associated protein 1，KAP-1)磷酸化， KAP-1磷酸化的药理作用可以激活处于潜伏期的HCMV，表明为维持HCMV感染潜伏期，可能需要抑制mTOR[19]。在单核细胞感染静止期间，HCMV以一种PI3K/AKT依赖的方式激活mTOR。尽管mTOR活性增加，但HCMV的裂解复制并未启动，推测可能需要一个阈值水平驱动复制，或者需要能与mTOR信号通路结合的其他因素驱动复制。

在细胞应激阶段，热休克转录因子1(heat shock transcription factor-1,HSF1)[20]负责表达应激相关蛋白，此通常与帽结构介导的翻译无关。在HCMV感染的单核细胞中，存在从HSF1到mTOR的正反馈环，其中抑制HSF1活性可降低mTOR活性。

在HCMV感染单核细胞期间，mTOR和HSF1之间独特的相互作用刺激产生抗凋亡mRNA的蛋白合成，如髓细胞白血病-1(myeloid leukemia cell-1，Mcl-1)蛋白、X染色体连锁凋亡抑制基因(XIAP)、热休克转录蛋白27(heat shock transcription protein 27，HSP27)，上述蛋白在生长因子处理后的细胞中不产生或微量产生,因此，可解释在细胞应激时HCMV感染能激活mTOR[19]的原因。与之前研究[20]一致，发现C10(一种选择性的Mcl-1小分子抑制剂)抑制Mcl-1可显著诱导感染单核细胞的凋亡和死亡。但是现在发现，失去Mcl-1对加速未感染单核细胞的凋亡影响很小。表明未感染的单核细胞在维持正常免疫监视功能的同时，可能选择性地清除感染HCMV的单核细胞。小分子抑制剂对XIAP的抑制也会导致感染单核细胞的死亡，但对未感染细胞的影响很小。因此，这组上调的蛋白代表了一种新的细胞抗病毒靶点，旨在选择性地清除HCMV感染的单核细胞，同时允许未感染的单核细胞维持其正常功能。潜伏感染的CD34+干细胞活性也高度依赖于Mcl-1，因此，Mcl-1抑制剂有可能消除静止和潜伏状态下的感染细胞。

总而言之，PI3K/AKT/mTOR通路在HCMV感染的三个阶段都具有重要作用[2]：(1) 确保在裂解感染过程中满足病毒生产代谢的需求；(2)促进细胞向潜伏期感染的转录；(3)维持被感染单核细胞的生存。因此，PI3K/AKT信号通路的抑制在抑制HCMV复制以及清除感染细胞的宿主方面具有双重作用，这一作用对移植患者的长期预后十分重要。

5 mTORi对HCMV感染的影响

依维莫司(EVR)、西罗莫司(SRL)是哺乳动物mTORi，具有免疫抑制和抗增殖作用。EVR已被证明可有效预防急性同种异体移植排斥反应。联合使用EVR，可以使钙调神经磷酸酶抑制剂(CNI)的副作用最小化，同时保持CNI药物效果和保护肾功能。临床数据还表明，与霉酚酸酯(MMF)相比，EVR与降低CMV疾病发生有关[21]。HCMV复制依赖于宿主细胞中2种mTOR途径中的1种，并且体外研究支持mTORi能够降低HCMV感染[22-23]。在心脏移植术后，与使用MPA相比，使用EVR可降低HCMV事件(病毒血症，临床症状和感染)的发生率[24]。

多项研究[24-25]结果显示，与MPA以及标准剂量TAC组患者相比，接受EVR和减少剂量TAC组患者中HCMV感染的发生率显著降低，接受EVR的肾移植受者可能不需要进行HCMV感染的预防，只有接受急性排斥治疗的患者或早期停用EVR的患者应进行常规的HCMV感染预防，此为一种显著节约成本的替代策略。

Höcker等[25]研究显示，HCMV高危(D+/R-)患者中采用EVR和低剂量CSA方案与接受标准CNI方案的患者相比，HCMV感染率和病毒复制水平均明显降低；基于EVR的免疫抑制方案使HCMV复制发生风险比标准的CNI方案低83%；在HCMV复制高风险的儿童肾同种异体移植受者中，与标准剂量CNI方案相比，由EVR和低剂量糖皮质激素(cyclosporin, CSA)组成的免疫抑制治疗可使HCMV感染率和复制水平明显降低。

6 mTORi未来应用展望

尽管有大量临床研究证实，mTORi能降低肾移植受者HCMV感染事件，但 Cristelli等[26]研究发现，在HCMV高危(D+/R-)且接受了兔源抗胸腺球蛋白诱导和他克莫司治疗的肾移植受者队列中，接受mTORi的患者HCMV感染/HCMV病的发生率未显著下降。mTORi对HCMV感染发生率的影响在HCMV高危(D+/R-)且未接受预防性抗病毒治疗的肾移植患者中没有在D-/R+肾移植受者中明显。

mTORi相较于其他免疫抑制，对肾、神经的毒性非常小，但也有其相关不良反应，如高脂血症、口腔溃疡、贫血等[13]，故在使用mTORi时需警惕药物不良反应的发生，同时当mTORi与其他免疫抑制相互组合时产生的不良反应需进一步研究探讨。此外 Cristelli等[26]考虑mTORi效应的大小可能与HCMV相关特异性记忆细胞的存在有关。但有关mTOR信号通路对浆细胞的分化和功能影响知之甚少。动物试验研究显示，mTOR信号通路在抗体反应和浆细胞分化的早晚期皆发挥着重要的作用。

Bak等[27]通过CD3/CD28交联反应测定SRL对幼稚T细胞和HCMV特异性T细胞的影响，发现SRL对幼稚T细胞和HCMV特异性CD8+T细胞有超出免疫抑制剂应用范围的选择性作用，可显著改善HCMV特异性效应记忆T细胞功能，对幼稚T细胞产生一定负性影响。

综上所述，有关HCMV感染对CD4+T细胞以及CD8+T细胞的mTOR信号通路的影响值得更加深入地研究。