支气管肺泡灌洗液应用TB-LAMP对菌阴肺结核的诊断价值

陈 霞，张建勇，赵建军

(遵义医科大学附属医院呼吸与危重症医学科呼吸二病区，贵州 遵义 563000)

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性传染病，其中以肺结核最常见，最主要的传播途径是经呼吸道传播[1]。根据我国实行的结核病分类标准(WS196-2017)[2]将肺结核分为原发性肺结核，血行播散性肺结核，继发性肺结核，气管、支气管结核，结核性胸膜炎。近年来，由于糖尿病和获得性免疫缺陷综合征发病率的增高，移民和流动人口的数量增加，多种耐药肺结核患者的增多以及许多地区和国家对结核病控制的无视等因素，导致全球结核病形势非常严峻[3-4]。根据中国疾病预防控制中心的数据统计，每年肺结核报告数位于国家法定甲、乙类传染病的前列[5]。因此，肺结核的预防与控制成为我国首要的公共卫生问题之一。目前，由于痰涂片抗酸染色检测阳性率低，以及痰培养法检测时间长、灵敏度低等缺点，肺结核的诊断困难，其中约70%为菌阴肺结核(3次痰涂片均阴性且痰培养阴性)，因此，肺结核漏诊、误诊等情况容易在临床上出现，更使得结核病的控制成为难题[6]。而怎样提高菌阴肺结核的阳性诊断率，成为临床医生日益关注的问题。近年来越来越多的研究表明，结核分枝杆菌环介导等温扩增技术(tuberculosis loop-mediated isothermal amplification， TB-LAMP)在结核病的诊断方面取得了良好效果，使得TB-LAMP成为了目前结核分子检测的有效工具之一[1,7]。故通过收集某院临床确诊菌阴肺结核患者的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，分别应用TB-LAMP和GeneXpert MTB/RIF技术对BALF进行MTB的检测，评估不同方法LAMP在菌阴肺结核中的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集某院2017年12月—2018年11月临床确诊为菌阴肺结核的患者254例。菌阴肺结核最终诊断参照《中国结核病防治规划实施工作指南(2008版)》涂阴肺结核的诊断标准及中华人民共和国卫生行业标准《肺结核诊断》WS 288-2017。研究对象纳入标准：(1)患者年龄为13～80岁；(2)所有患者3次痰找抗酸杆菌(即时痰、夜间痰、晨痰)均为阴性且1次痰培养阴性。254例患者在行支气管镜检查前均未行抗结核治疗，均在签署支气管镜检查知情同意书后行支气管镜检查，在病变部位进行支气管肺泡灌洗，收集BALF标本254份。BALF标本随机分为2组(LAMP组、GeneXpert组)，分别采用TB-LAMP、GeneXpert MTB/RIF技术进行MTB核酸检测，然后对所有患者进行涂片抗酸染色和罗氏培养，收集资料进行统计学分析。本研究均在医院伦理委员会监管下完成。

1.2 仪器与试剂 由荣研生物科技有限公司提供TB-LAMP检测试剂盒及恒温扩增仪，由美国Cepheid 公司提供GeneXpert MTB/RIF 检测试剂盒，由中国珠海贝索生物技术有限公司提供抗酸染色液试剂盒，所有罗氏培养的培养基均按照《结核病诊断实验室检验规程》制备。所有试剂均在有效期内使用。

1.3 研究方法

1.3.1 涂片抗酸染色 将支气管镜刷检物进行涂片，待其自然干燥后使用苯酚复红染液染色，5 min后用流水冲洗染色液，沥干水分后滴入脱色液，等待1 min后再滴加亚甲蓝溶液染色30 s，最后水洗干燥后进行镜检。

1.3.2 罗氏培养 将BALF样本中加入等体积的4.0%NaOH溶液，振荡摇匀后室温静置10 min，取沉淀1 mL接种到酸性罗氏斜面培养基上，使用37℃培养箱孵育，连续8周观察MTB生长情况，8周后未见MTB生长则为阴性。若酸性罗氏斜面培养基上见菌落生长，则需进一步行抗酸染色检测，检测结果为阳性时，再采用对硝基苯甲酸 (PNB)鉴定菌落为非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacterium，NTM)还是MTB[8]。

1.3.3 TB-LAMP BALF样本3 000 r/min离心15 min，弃上清液，取其沉淀30 μL用于TB-LAMP检测，按照LAMP试剂盒操作流程进行检测，40 min后由仪器自动判读结果。

1.3.4 GeneXpert MTB/RIF BALF样本3 000 r/min离心20 min，弃上清液，取其沉淀1 mL用于GeneXpert MTB/RIF技术检测，按照GeneXpert MTB/RIF检测操作流程进行检测，2 h后观察结果。

1.4 统计方法 应用SPSS 21.0进行统计学分析，计量资料采用百分比描述，不同方法间配对计数资料的比较采用McNemar检验，率的比较采用χ2检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 共收集254例菌阴肺结核的患者，其中男性146例，女性108例，平均年龄为(49.04±17.18)(13～80)岁。LAMP组共96例，其中男性53例，女性43例，平均年龄为(50.23±16.57)(13～79)岁。GeneXpert组共158例，其中男性93例，女性65例，平均年龄(48.32±17.50)(13～80)岁。两组患者性别及年龄比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。

2.2 LAMP组涂片抗酸染色、罗氏培养、TB-LAMP检测结果 对LAMP组96例菌阴肺结核患者均进行涂片抗酸染色、罗氏培养、TB-LAMP，阳性率分别为4.17%(4/96)、18.75%(18/96)、52.08%(50/96)，其中4例涂片抗酸染色阳性患者中罗氏培养均阳性。TB-LAMP与涂片抗酸染色、罗氏培养MTB检测阳性率比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 TB-LAMP与涂片抗酸染色、罗氏培养MTB检测结果比较(例)

2.3 GeneXpert组涂片抗酸染色、罗氏培养、GeneXpert MTB/RIF检测结果 对GeneXpert组158例菌阴肺结核患者均进行涂片抗酸染色、罗氏培养、GeneXpert MTB/RIF，MTB检测阳性率分别为3.80%(6/158)、12.66%(20/158)、54.43%(86/158)，其中6例涂片抗酸染色阳性患者中罗氏培养均阳性。GeneXpert MTB/RIF与涂片抗酸染色、罗氏培养MTB检测阳性率比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 GeneXpert MTB/RIF与涂片抗酸染色、罗氏培养MTB检测结果(例)

2.4 TB-LAMP与GeneXpert MTB/RIF检测结果比较 TB-LAMP与GeneXpert MTB/RIF对菌阴肺结核患者检出MTB阳性率分别为52.08%、54.43%，两种方法阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=0.13，P>0.05)。见表3。

表3 TB-LAMP与 GeneXpert MTB/RIF MTB检测结果比较(例)

3 讨论

众所周知，我国是全世界结核病高发国家之一。根据2018年WHO估计，全世界约有1 000万新发结核病患者，我国新发结核病患者约88.9万，约占全世界病例数的9%，而各地区结核病发病率存在明显差异，其中以农村区域为主；另外，结核病在全球疾病死因中占第9位，也是单一病原体感染造成死亡的首要原因之一，造成死亡人数高于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染/艾滋病[6]。因此，提高结核病快速诊断方式以及有效控制结核病的传播是治疗结核病的关键[9]。目前在基层结核病诊疗机构中，以痰涂片抗酸染色以及痰MTB培养作为诊断肺结核的主要依据[10]，但涂片抗酸染色找MTB的阳性率约20%，痰MTB培养阳性率约30%[11]，且MTB培养耗时长，一般需要4～8周，无法满足结核病快速诊断的要求。因此，对于我国这样的发展中国家，简单快速、高效经济的结核病检测方法在临床中具有重要意义。

LAMP是由Gelaw等[12]发现的一种新型核酸扩增技术，该技术的引物组由两个外部(F3和B3)引物、两个内部引物(前向内部引物FIP和向后内部引物BIP)和环状引物(环向前和环向后)组成，四个不同特异性的引物结合到六个不同区域的靶基因使其具有很高的特异性。LAMP反应可以简单地在等温条件下进行高效的链置换DNA聚合酶反应，通过链置换DNA合成的自我循环使靶序列长度在300 bp以内，最后形成不同长度的茎-环结构的DNA链，使其具有高灵敏度。LAMP技术具有高效性是由于双链DNA的扩增不需要预先热变性，核酸反应均可在1 h内完成且产物可以扩增至109倍[13-15]。最后，可以通过目测其荧光颜色和/或浊度的变化来判读结果，而不需要凝胶电泳或其他检测仪器标记的探针，且TB-LAMP技术全程均使用封闭系统，从而最大限度地降低了污染的风险。

本研究中254例菌阴肺结核患者行支气管检查取支气管镜刷检物或BALF标本进行涂片抗酸染色、罗氏培养、TB-LAMP或GeneXpert MTB/RIF检测，结果显示，在临床诊断为菌阴肺结核的254例患者中，涂片抗酸染色阳性10例(阳性率为3.94%)，罗氏培养阳性38例(阳性率为14.96%)，其中10例涂片抗酸染色阳性患者的罗氏培养均为阳性；由此可见，临床上考虑可疑菌阴肺结核患者可以进一步行支气管检查取支气管镜刷检物或BALF标本，进行涂片抗酸染色及MTB罗氏培养，以提高菌阴肺结核的诊断率。254份BLAF标本随机分为两组(LAMP组、GeneXpert组)，在LAMP组96例患者中，TB-LAMP MTB检测阳性率为52.08%，其中4例涂片抗酸染色阳性患者中TB-LAMP均阳性；18例罗氏培养阳性患者中有1例TB-LAMP阴性，导致罗氏培养阳性而TB-LAMP阴性的原因考虑与LAMP操作人员采集标本部位以及标本量相关[16]。

本研究菌阴肺结核患者进一步行涂片抗酸染色、罗氏培养、TB-LAMP及GeneXpert MTB/RIF MTB检测阳性率分别为3.94%(10/254)、14.96%(38/254)、52.08%(50/96)、54.43%(86/158)。因此，菌阴肺结核患者行支气管镜肺泡灌洗采集BALF标本，做涂片抗酸染色、罗氏培养、TB-LAMP及GeneXpert MTB/RIF检测均可以提高结核病的诊断率。相关研究[17]指出，通过支气管镜获得的支气管镜刷检物标本或BALF标本对其进行涂片抗酸染色或MTB罗氏培养阳性率高于痰标本阳性率，且对结核病诊断的灵敏度有所提高，本研究结果与此一致。由WHO推荐的新型结核分枝杆菌快速检测方法GeneXpert MTB/RIF检测技术，通过荧光定量核酸扩增方法检测MTB利福平耐药基因rpoB的81 bp耐药核心区是否发生突变，可以在快速检测MTB同时还可以检测利福平耐药[18]。本研究通过对TB-LAMP与GeneXpert MTB/RIF技术进行比较，评估TB-LAMP的效能，研究结果显示TB-LAMP及GeneXpert MTB/RIF MTB检出阳性率分别为52.08%、54.43%，两者比较，差异无统计学意义(P>0.05)，与陈伊等[19]研究结果相同。

与涂片抗酸染色相比，首先TB-LAMP不需要通过专业技术人员进行镜检，其次灵敏度及特异度均高于涂片抗酸染色，最重要的是还可以区分MTB与NTM[20]；与罗氏培养相比较，TB-LAMP阳性率高于罗氏培养，而且TB-LAMP具有检测过程操作简单、快速等优点；与GeneXpert MTB/RIF相比，TB-LAMP是一种等温DNA扩增技术，不需要提供专门的核酸扩增设备，同时也不需要高难度的技术支撑，并且在检测设备费用及设备环境要求方面均较低，从而给发展中国家或地区的结核病防治减轻压力[21]。因此， TB-LAMP为结核病的快速高效诊断提供了替代方法，对于临床诊断肺结核有重要意义。但TB-LAMP在检测MTB利福平耐药方面欠缺，因而仅能用于对低风险耐药结核患者进行检测[22]，在临床工作应用中有一定的不足。

另外，近年来越来越多的研究报道TB-LAMP与GeneXpert MTB/RIF技术在痰标本检测中的应用，也取得了良好的效果[20,23]，但通过BLAF标本行TB-LAMP检测MTB目前仍缺乏进一步探究。本研究发现在临床诊断的菌阴肺结核患者中，TB-LAMP阳性率明显高于涂片抗酸染色以及罗氏培养，且与GeneXpert MTB/RIF检测具有一致性，可为临床上结核病的诊断提供新方法，值得在临床中进一步推广应用。