臭氧治疗对膝骨性关节炎关节液中肿瘤坏死因子-的影响*

张作丹吕辉照赵枫李传玲曾燕坤

膝关节骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退变为特征的慢性关节疾病，是中老年人常见的一种关节疾病。在该病理过程中，包括肿瘤坏死因子-（tumornecrosisfactor-，TNF-）在内的多种细胞因子参与调节OA的炎性反应，而TNF-也能反映膝关节骨性关节炎的转归[1]。近年来，臭氧已逐步应用于膝关节骨性关节炎的治疗，但其确切机制尚未完全明了。本研究旨在观察膝关节腔内臭氧治疗对关节液中TNF-水平的影响，探讨该疗法的TNF-机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

自2012年2月至2016年2月，在本院纳入确诊膝关节骨性关节炎的患者77例，其中男30例，女47例；年龄50～81岁，平均（62.20±6.60）岁；病程17～70个月，平均（46.20±18.10）个月。所有患者均为单侧膝关节，其中左侧57例，右侧20例；VAS评分5～9分，平均（7.67±1.11）分；LKSS评分30～60分，平均（38.67±5.77）分。所有患者根据就诊日期采用SPSS随机函数随机分为两组，其中治疗组45例，采用膝关节腔内注射臭氧治疗；对照组32例，采用膝关节腔内注射灭菌空气治疗。两组在年龄、性别比、病程、侧别、治疗前VAS评分与LKSS评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。该研究已通过泉州医学高等专科学校及解放军第910医院伦理管理委员会审核，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 诊断标准

遵循2008年中华医学会骨科学分会修订的膝关节骨性关节炎诊断标准[2]：近1个月内反复膝关节疼痛；影像学包括站立位X线片提示关节间隙变窄、软骨下骨硬化和/或囊性变、关节缘骨刺形成；关节液（2次及以上）清亮、黏稠，WBC＜2 000个/mL；中老年（≥50岁）；晨僵≤30 min；活动时有骨摩擦感（音）。综合以上各项，符合+或+++或+++即可诊断为膝关节骨性关节炎。

1.3 纳入标准及排除标准

1.4 治疗方法

患者取平卧位，以髌骨下缘的水平线与髌骨外缘或内缘的垂直交点为穿刺点，经穿刺点向内或向外进针入关节腔，也可经髌韧带的任何一侧、紧贴髌骨下方向后进针。治疗组：采用医用臭氧发生器（赫尔曼公司，德国）制备臭氧，用一次性注射器抽取浓度为40 g/mL的医用臭氧20 mL注入，穿刺处无菌辅料覆盖并稍按压10 min。每周注射1次，5周为一疗程。对照组：采用小型空气灭菌器（东信高科有限公司提供，型号：TS-01）制备灭菌空气，用一次性注射器抽取灭菌空气20 mL注入膝关节腔。每周注射1次，5周为一疗程。

1.5 标本采集与检测方法

标本采集和保存方法：从髌骨上方、股四头肌腱外侧采用注射器抽取关节液1～3mL，并留于血清管中，2 h内在4 500转/min条件下离心 10 min，留取上清液分装于Eppendorf管中，快速冷冻，置于-70℃低温冰箱保存待测。

检测方法：采用TNF-酶联免疫试剂盒（上海岚派生物科技有限公司提供）检测医用臭氧治疗前（治疗前）及治疗后第1～12周每周的关节液中TNF-含量。

1.6 观察指标

采用疼痛视觉模拟评分（VAS）记录治疗前与治疗后第1～12周每周的疼痛情况，0分表示没有疼痛，10分表示剧烈疼痛。膝关节功能评分采用 Lysholm膝关节评分量表（Lysholmknee score scale，LKSS），正常为100分，分值越小，表示功能障碍越严重。

1.7 统计学方法

采用 SPSS 20.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差的形式表示。两组间各时间点的TNF-含量比较采用两独立样本t检验；治疗组治疗前、后的TNF-含量、VAS评分与LKSS评分比较分别采用单因素方差分析；治疗组TNF-含量与VAS、LKSS的相关性采用Pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

所有77例患者均获得随访，随访时间6～27个月，平均（15.66±6.92）个月。

2.1 两组间各时间点TNF-含量比较

治疗组臭氧治疗后第1周与第2周的TNF-含量与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；第3～12周，治疗组的 TNF-含量逐渐下降，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。具体数据见表1、图1。

表1 治疗组与对照组各时间点的TNF-含量比较（ g/mL）

图1 治疗组与对照组各时间点的TNF-含量曲线图

2.2 治疗组内各时间点间的TNF-含量比较

治疗组内治疗前与第1周、第1周与第2周、第10周与第11周、第11周与第12周的TNF-含量比较差异无统计学意义（P＞0.05），而第2～10周间各时间点的TNF-含量比较差异有统计学意义（P＜0.01）。具体内容见图2。

图2 治疗组内各时间点间的TNF-含量比较：表示两个时间点间的TNF-含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）；●表示两个时间点间的TNF-含量比较差异有统计学意义（P＜0.01）

2.3 治疗组内各时间点间的VAS评分变化

治疗组内治疗前与第1周、第1周与第2周的VAS评分比较差异无统计学意义（P＞0.05），其余各时间点的VAS评分比较差异有统计学意义（P＜0.05）。具体数据见图3。

图3 治疗组内各时间点间的VAS评分比较：表示两个相邻时间点间的VAS比较差异无统计学意义（P＞0.05）；●表示两个相邻时间点间的VAS评分比较差异有统计学意义（P＜0.01）；▲表示两个相邻时间点间的VAS评分比较差异有统计学意义（P＜0.05）

2.4 治疗组TNF-含量与VAS评分的相关性分析

治疗组 TNF-含量与 VAS评分呈正相关，相关系数r=0.657，P=0.001，P＜0.01（见图 4）。

图4 治疗组TNF-含量与VAS评分相关性分析

2.5 治疗组内各时间点间的LKSS评分变化

治疗组内各时间点间的LKSS评分比较见图5。

图5 治疗组内各时间点间的LKSS评分比较：表示两个相邻时间点间的LKSS比较差异无统计学意义（P＞0.05）；●表示两个相邻时间点间的LKSS评分比较差异有统计学意义（P＜0.01）

2.6 治疗组内TNF-含量与LKSS评分的相关性分析

治疗组内TNF-含量与LKSS评分呈负相关，相关系数r=0.701，P=0.001，P＜0.01（见图 6）。

图6 治疗组内TNF-含量与LKSS评分相关性分析

2.7 不良反应

所有患者均未出现注射后膝关节疼痛加重或红肿、皮温升高等炎症反应，无一例出现穿刺点感染。

3 讨论

3.1 TNF-与骨性关节炎的关系

骨性关节炎以关节软骨退行性改变为基础病变，虽然至今其确切发病机制尚未完全明确，但多种炎性因子参与其中。其中，TNF-是主要的炎性介导因子，它可以通过介导IL、LRG1、MKK4等炎性因子或直接通过抑制 RNA表达加速软骨细胞的凋亡，继而促进关节软骨的退变[3-5]。Fryer等 [6]的研究证实，膝关节液中 TNF-浓度与关节理化病变有关，提示TNF-可能是骨性关节炎病理过程中的主要炎性因子，对关节软骨破坏起到重要的中介作用。由于TNF-在骨性关节炎病理过程中的重要作用，Flemming等[7]认为TNF-可以作为衡量OA严重程度的辅助标准之一，通过TNF-含量的变化，可以反映OA病情进展和治疗效果，但该观点尚需更多的证据支持。

3.2 臭氧对TNF-水平的影响

目前，膝关节骨性关节炎的阶梯治疗主要包括理疗、非甾体类抗炎镇痛药与软骨营养药、玻璃酸钠及手术治疗等，但臭氧疗法作为近年来新兴的一种治疗方法，在临床上和实验中取得了一定的治疗效果 [8-9]。但其作用机理尚未完全明确，可能与臭氧的强氧化作用有关，在人体内可能通过中和或抑制多种炎性介质及致炎物质的合成、释放，产生抗炎、镇痛、改善关节功能的作用 [10]。虽然臭氧治疗过程的TNF-途径是其可能作用机制之一，但该过程中TNF-如何变化及对膝关节功能的影响尚无文献报道。所以本实验旨在研究膝关节骨性关节炎臭氧治疗过程中的TNF-含量变化情况，以及TNF-与疼痛和膝关节功能的相关性。

本研究中，臭氧治疗第1周与第2周时与对照组的TNF-含量比较无差异，而从第3周后，治疗组的TNF-含量持续下降。这种原因可能是膝关节腔注射臭氧后，臭氧并非直接抑制滑膜细胞TNF-的表达，可能还需要某些中介途径，从注射臭氧到TNF-表达获得抑制需要一定的时间，本研究发现这个时间间隔为2周。所以在进行臭氧治疗时，临床医师应向患者介绍这种疗法存在约2周的起效准备期，增加患者的治疗依从性。而经过2周的准备期后，滑膜细胞的TNF-表达开始出现抑制，体现为关节液中的TNF-含量持续明显下降，第3周以后各时间点的TNF-含量均低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），这也证实Noori-Zadeh等关于臭氧疗法可以影响骨性关节炎患者关节液中的TNF-水平的推测 [11]。而且这种影响不止体现在治疗期，在臭氧治疗结束后第6～10周各时间点的 TNF-含量仍持续下降，说明臭氧对TNF-表达的抑制存在一个较长的延迟效应期，可以在臭氧治疗结束后继续对关节液中的TNF-水平施加影响，这是目前文献尚未报道的。但在第11周与第12周时，TNF-含量变化再次进入平台期，两个时间点的TNF-含量下降开始放缓，比较无统计学差异，这说明臭氧对TNF-的抑制在第11、12周时开始减弱，但由于该研究的随访时间较短，无法明确第12周以后的TNF-水平维持的时间，尚需进一步研究。所以在进行臭氧治疗膝关节骨性关节炎时，应了解臭氧对TNF-的影响具有2周的起效准备期，而起效后可以存在至少10周的效应期。

3.3 TNF-对OA膝关节功能的影响

TNF-对关节软骨与关节滑膜的影响及与疼痛的关系已有较多文献报道。Nees等[12]发现TNF-可促进滑膜成纤维细胞样增殖，增强滑膜细胞RNA的表达功能，而成为滑膜组织纤维化及滑液中细胞因子水平异常升高的诱导因素之一，这一因素可能改变关节软骨的微环境，从而导致OA的静息性疼痛。Shore[13]的研究显示TNF-诱导的蛋白激酶CK2途径导致软骨细胞的凋亡和软骨基质的溶解，在OA运动性疼痛中起到重要的作用。虽然OA引起的疼痛是在许多因素共同作用下产生的，但臭氧介导的TNF-水平变化对疼痛的影响在该研究中获得证实。本研究发现，随着TNF-水平的下降，相应的膝关节VAS评分也随之下降，两者之间具有正相关性，臭氧通过抑制TNF-表达的途径参与了疼痛的控制，而且VAS评分的变化与TNF-类似，VAS评分在开始治疗的第1周和第2周变化不明显，但从第3周开始VAS评分持续下降，这可能与臭氧对 TNF-的变化有延迟效应有关。但该研究无法判断臭氧疗法的疼痛控制是由TNF-完全主导或占据多大的作用，因为在第11周与第12周这两个时间点，虽然TNF-的变化无统计学差异，但VAS评分水平仍持续下降，这个过程中可能还会有其他疼痛介导途径参与，还需要对这些疼痛介导途径进一步研究。

与疼痛控制不同的是，臭氧疗法对膝关节功能的影响非常滞后。TNF-与膝关节的LKSS功能评分虽然存在负相关的关系，TNF-途径对膝关节骨性关节炎的功能康复具有一定的作用，但LKSS评分在治疗的前6周变化不明显，而需要到第7周开始才会改善，功能改善的延迟性非常明显，这说明在臭氧治疗中TNF-途径并非完全主导，尚有其他途径参与。臭氧治疗对膝关节骨性关节炎具有良好的疗效，治疗后第12周的LKSS功能评分达到（89.11±2.71）分，但TNF-在膝关节功能恢复中可能只起到部分作用。

3.4 不足之处

综上所述，臭氧疗法可以抑制膝关节骨性关节炎滑膜细胞TNF-的表达，该途径在早期疼痛控制中具有重要作用，但在关节功能恢复中可能不起主导作用，而且远期是否对膝关节疼痛仍具有控制作用尚需进一步研究。