桃红内异散对大鼠子宫内膜异位病灶MicroRNA-126的影响*

苗振立 李 伟

子宫内膜异位症近年来的发病率明显上升，常常导致不孕、慢性盆腔痛、性交痛、肛门坠痛、痛经及月经不调等等症状，其在形态学上呈良性表现，但在临床行为学上具有恶性肿瘤的特点，如种植、侵袭及远处转移。西医治疗采用高效孕激素或孕激素拮抗剂或促性腺激素释放激素激动剂，但常常具有胃肠道反应、肝功能损害及潮热、骨质丢失等等不良作用[1]。

中医学把子宫内膜异位症归于“痛经”“血瘕”等症，血瘀是其主要病机[2]。治疗子宫内膜异位症的重要方法之一是活血化瘀软坚散结法，其作用机理亦是目前研究热点之一。桃红内异散是我院张会主任医师秉承活血化瘀软坚散结法以桃红四物汤为基方发展而成的治疗子宫内膜异位症的有效验方，本实验研究桃红内异散对子宫内膜异位症模型大鼠异位病灶中的mircroRNA-126表达的影响，从而为明确其作用机理奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物SPF级成熟雌性未交配过的SD大鼠40只，3月龄，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK-(军)2012-0004。

1.1.2 药物桃红内异散药物组成：当归12 g，赤芍10 g，桃仁10 g，红花10 g，香附12 g，枳壳12 g，三棱10 g，莪术10 g，鳖甲10 g，焦山楂10 g，甘草6 g。中药颗粒剂由江阴天江药业有限公司提供。孕三烯酮胶囊由北京紫竹药业有限公司有限公司生产。

1.1.3 试剂miRcute miRNA isolation kit(目录号： DP501)，miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(目录号：KR201)，miRcute miRNA Detection Kit(SYBR Green)(目录号：FP401)及MircroRNA-126、U6均购于天根生物科技有限公司。其中MicroRNA-126基因引物序列为ACACTCCAGCTGGGCATTATTACTTTTGG。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分组将大鼠适应性饲养1周后，对40只大鼠随机编号，采用染色法对实验动物进行标记，采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、桃红内异散组、孕三烯酮组，每组10只。造模前一天在将要造模的大鼠皮下注射己烯雌酚,剂量为0.1 mg/kg,使手术时大鼠统一处于动情期。模型制作:将大鼠用 1 %戊巴比妥钠按30 mg/kg剂量进行腹腔麻醉,腹部脱毛,常规消毒、铺巾(保持手术中的无菌条件)。于右下腹位置切开皮肤及腹壁,切口约2～3 cm,钝镊找到并分离出大鼠的右侧子宫,在靠近输卵管的部位,套扎约 1 cm 的一段子宫体,剪下被套扎的部分,迅速置于盛有生理盐水的培养皿中。沿系膜部位剪开管状子宫,切割成 4 mm×4 mm 大小的子宫片。在手术切口的中段,从腹肌与皮下筋膜层之间,由右向左打一隧道,将切割好的子宫片平整的置入隧道底部,使内膜面紧贴腹肌,固定,逐层连续缝合腹部切口,常规关腹。注意观察大鼠的呼吸、心跳,待其自然苏醒。异位内膜观察:手术后每周触摸包块 2 次,观察包块有无及大小。假手术组除不进行子宫内膜移植外，其它操作同模型组。

1.2.2 给药造模后4周开始给药，共给药4周，大鼠灌胃量为1 ml/100 g，假手术组及模型组给予0.9%氯化钠溶液灌胃。根据文献[3]中的方法进行大鼠用药剂量的换算(大鼠与人体的每千克体质量剂量折算系数为6.25)，桃红内异散组：75 g·kg-1·d-1，孕三烯酮组0.25 g·kg-1·w-1。

1.2.3 检测指标及方法造模后4周，触摸腹部包块直径1 cm以上，开腹观察异位内膜生长情况，并光镜下观察各移植组织病理变化，以移植组织有子宫内膜组织的上皮细胞或间质细胞存在为造模成功标准。模型组、假手术组、桃红内异散组及孕三烯酮组均存活10只。采用实时聚合酶链反应检测mircroRNA-126的表达。根据试剂盒进行RNA提取和转录，按照试剂盒说明在实时PCR仪上进行扩增，以U6作为内参，分管同机进行PCR反应，重复试验3次。用荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

2 结果

各组中mircroRNA-126的比较：与假手术组相比，模型组 mircroRNA-126显著降低(P<0.01)；与模型组相比，桃红内异散组及孕三烯酮组mircroRNA-126水平显著升高(P<0.01)；孕三烯酮组mircroRNA-126水平与桃红内异散组相当(P>0.05)；提示桃红内异散组可有效提高异位病灶组织mircroRNA-126水平(P<0.01)，说明桃红内异散在改善异位病灶组织基因转录水平上疗效显著。见表1。

表1 各组mircroRNA-126基因转录水平 (只，

注：与假手术组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01；与孕三烯酮组比较，3)P> 0.05

3 讨论

微小RNA(microRNA，miRNA)是一庞大的高度保守的单链非编码RNA家族，各家族成员由长约22 个核苷酸的内源性单链非编码型的小分子 RNA组成，其功能是通过与靶基因 mRNA 的 3＇端非翻译区(3＇untranslated region，3 ＇UTR) 相结合，降解靶基因或者抑制靶基因翻译而达到负性调控的作用，进而参与调节多种生命体活动[4]。

mircroRNA-126是目前研究microRNA的热点之一，由人类染色体9q34.3中EGFL7基因的第7个内含子编码，它能够直接与DNA结合，从而阻止mRNA的转录、翻译和降解，在不同恶性肿瘤发生发展及转移过程中起抑癌基因或癌基因的功能,在子宫内膜癌中也起重要作用[5～8]。mircroRNA-126还是血管内皮细胞中表达最丰富的microRNA，在整个毛细血管以及较大的血管内皮细胞中均会表达，通过影响不同的转录因子从而控制血管生成[9]。有研究发现mircroRNA-126表达与血管内皮黏附因子-1表达呈负相关，mircroRNA-126低表达时可增高血管内皮黏附因子-1表达水平而促使白细胞粘附于血管内皮细胞并参与新生血管的生成[10]，且有研究表明mircroRNA-126可结合在VEGF-A mRNA的3ˊUTR区域，抑制靶基因SPRED1和PIK3R2，通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇三激酶(PI3K)途径抑制 VEGF 号径，从而下调血管生长因子VEGF的表达水平，而血管生长因子VEGF可通过激活MAP激酶途径调节血管内皮细胞增殖，迁移和黏附，加强 VEGF基因的表达对于血管发生和维持血管完整性是非常必要的[11,12]。

血管生成是子宫内膜异位症发病机制的基础，子宫内膜异位症病灶周围的血管化程度是影响内膜细胞增殖、转移的重要因素，血管内皮生长因子(VEGF)是在血管生成中占首要地位的促血管生长因子。VEGF家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盘生长因子(PIGF)，Moety 等通过检测了61例子宫内膜异位症患者与51例健康妇女的血清和腹腔液中VEGF-A的浓度，发现子宫内膜异位症患者的血清中VEGF-A浓度 [(2158.37±1026.87)pg/ml]显著高于健康妇女[(286.83±77.07)pg/ml]，且腹腔液中的 VEGF-A 的浓度[(3174.67±2857.60)pg/mL]与健康妇女 [(214.30±68.74)pg/mL]比较，差异也有统计学意义(P<0.001)[13]。而子宫内膜异位症患者血清中VEGF水平显著提高，可促进异位内膜细胞的转移、黏附和生长，进而破坏周围组织，导致病情加重；且有研究者发现子宫内膜异位症的严重程度与患者血清中VEGF的含量成正比，r-AFS分期为Ⅲ ～ Ⅳ期患者血清VEGF 含量明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者[14,15]。

中医认为“瘀血阻滞胞宫、冲任”是子宫内膜异位症的基本病机，而瘀之形成，又与脏腑功能失调、气血失调及感受外邪等因素相关。故本病治疗须坚持以“活血化瘀”为主要方法，同时根据“血瘀”之因，辅以相应的理气、行气、消癥诸法，当于活血化瘀之中，配伍软坚散结消癥之品。

桃红内异散以桃红四物汤为基础加减，去熟地黄，加香附、枳壳、三棱、莪术、鳖甲、焦山楂等组合而成；此方以祛瘀为核心，辅以理气、行气、消癥。方中以破血之品桃仁、红花为君药，力主活血化瘀。以甘温之当归滋阴补肝、养血调经;芍药养血和营，以增补血之力；川芎、焦山楂活血行气、祛瘀止痛，尤其川芎不仅养血活血，更能行血中之气，增强逐瘀之力；三棱、莪术、鳖甲增强活血化瘀之功，破瘀消癥；诸药为臣药，可使瘀血祛而不伤阴血。香附、枳壳行气止痛，为佐药。甘草调和诸药，为使药。全方配伍得当，以逐瘀活血和行气药物居多，使气帅血行，更好发挥其活血逐瘀，破癥消结之力，使瘀血祛、新血生、气机畅，化瘀止痛。

本研究表明,异位内膜组织中microRNA-126显著降低，从而可上调VEGF的表达，促进异位内膜组织中的微血管生成与异位内膜的转移、黏附与生长。而桃红内异散可显著上调异位内膜组织中的microRNA-126的表达，从而可抑制VEGF的表达，减少异位内膜组织中微血管的生成及异位内膜细胞的生长，这可能为桃红内异散的作用机理之一。桃红内异散对异位内膜中microRNA-126的影响与孕三烯酮无统计学差异，这表明桃红内异散在治疗子宫内膜异位症中的效果与孕三烯酮相近，可作为一种有效的治疗子宫内膜异位症验方，尤其适用于不耐受孕三烯酮不良作用的患者。