酵母双杂交技术构建稀有鮈鲫不同雌激素受体亚型的重组荧光酵母

季晓亚，杨明嘉，黄超，袁圣武，周小红，饶凯锋，马梅,*，王子健

1. 中国科学院生态环境研究中心，中国科学院饮用水科学与技术重点实验室，北京 100085 2. 中国科学院大学资源与环境学院，北京 100190 3. 清华大学环境学院，环境与健康传感技术中心，ESPC国家重点联合实验室，北京100084

内分泌干扰物是一类干扰生物体保持自身平衡和调节发育过程中天然激素的合成、分泌、转运、结合或代谢等作用的外源性物质，包括环境雌激素(environmental estrogen, EEs)、环境雄激素和环境甲状腺激素等。目前，内分泌干扰物中有超过200种的化学物质已被证实为EEs[1]，EEs来源多样，分布广泛，已成为研究者关注的重点。经典的EEs信号转导是以配体依赖的方式实现的，也被称为基因组途径，由雌激素核受体(nuclear estrogen receptor, nER)介导[2]，通过扩散进入细胞的类雌激素物质或细胞内合成的雌激素识别nER的配体结合域(ligand binding domain, LBD)，使得受体的构象发生改变，形成同源二聚体，随后募集共调节因子包括共激活因子和共抑制因子，进而促进或抑制EEs-nER复合物与下游靶基因启动子雌激素反应元件(ERE)的结合，从而调控基因的转录[3]。根据此途径中EEs与nER的结合、共激活因子和ERE的作用，研究者们开发了多种EEs活性的离体检测方法，如ER竞争结合试验、重组酵母雌激素筛检法、荧光素酶表达基因法(ER-CALUX)等[4]，但这些方法都是基于EEs对人体ER的影响而评估其雌激素效应，为了更全面地分析EEs可能导致的生态风险，需要考虑EEs对鱼类模式生物ER的影响。

稀有鮈鲫是我国特有的一种淡水鱼类，其易于实验室培养，培养温度范围宽，生命周期短，受精率和孵化率高，已成为广泛应用于水生毒性研究的模式生物。由于生态系统的敏感种和优势种具有较强的地域特性，使用我国本土的受试生物既能真实地反映化学品对我国本土生态系统的影响，又可以对欧美发达国家主导的化学品测评体系进行补充[5]。研究表明，哺乳动物中表达ERα和ERβ这2种雌激素核受体亚型，而在硬骨鱼体内，普遍存在3种雌激素受体亚型ERα、ERβ1和ERβ2介导雌激素的作用，其中，在虹鳟鱼中还发现ERα的亚型ERα1和ERα2。这些不同亚型的ER在鱼体内具有独特的组织分布模式、不同的配体亲和力和配体暴露后不同的基因调控模式[6]，有研究报道，青鳉、三刺鱼、斑马鱼、鲤鱼和拟鲤中不同亚型ER的LBD在ER对EEs的识别及响应中起着关键性的作用[1]。同样地，在稀有鮈鲫体内存在ERα、ERβ1和ERβ2这3种ER亚型，Wang等[7]通过对稀有鮈鲫ERα、ERβ1和ERβ2各功能域序列比对分析发现，DNA结合结构域(ERα/β1: 90.9%、ERα/β2: 97%、ERβ1/β2: 90.1%)和LBD(ERα/β1: 58.4%、ERα/β2: 59.7%、ERβ1/β2: 74.1%)具有较高的相似性，表明三者在识别反应元件和调控基因转录方面具有高度的相似性，但在配体亲和力方面可能具有一定程度的差异。目前，有关稀有鮈鲫不同ER亚型的LBD与配体间相互作用的研究仍未见报道。

重组雌激素受体基因酵母是根据EEs-nER复合物与共激活因子之间的相互作用而构建的，用以评估EEs的类/抗雌激素效应的同时，也可以表明EEs与ER-LBD的相互作用。为了更加快速方便地检测雌激素效应，本实验室对传统的双杂交宿主酵母Y187的基因进行了改良，在其基因组上插入了可以被GAL4调控的报告基因荧光素酶(luciferase, Luc)的片段，已构建成Y187-Luc酵母。本研究利用酵母双杂交技术在Y187-Luc中构建不同稀有鮈鲫ER亚型的重组荧光双杂交酵母，用于检测环境雌激素和环境水体的雌激素活性，同时也可以研究稀有鮈鲫不同ER亚型的LBD与配体之间的相互作用。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验仪器

恒温振荡培养箱(HZQ-F100，中国，哈东联)；高压高温灭菌锅(MJ，美国，STIK)；超净工作台(SCB，中国，哈东联)；量程不同的移液器(德国，Eppendorf)。

1.2 试剂材料

17β-雌二醇(E2，纯度99%)、双氢睾酮(DHT，纯度99%)、9-顺维甲酸(9-cisRA，纯度98%)、三碘甲状腺原氨酸(T3，纯度98%)和孕酮(PG，纯度98%)购于百灵威化学品有限公司，柠檬酸、柠檬酸钠和D-荧光素购于美国Sigma公司。感受态大肠杆菌DH5α、质粒小提试剂盒、凝胶回收质粒试剂盒、1kb DNA marker、氨苄青霉素和卡那霉素均购自Tiangen生物试剂公司。酵母转化试剂盒购于Clontech公司。诱饵质粒(pGBKT7-ERα-LBD、pGBKT7-ERβ1-LBD和pGBKT7-ERβ2-LBD)的构建由北京华大科技公司完成，DNA序列测定由北京博迈德科技发展有限公司完成。Y187-Luc酵母菌株由本实验室自主合成[8]，pGAD424-GRIP1质粒由美国加州大学Stallcup教授惠赠且保存在本实验室[9]。

1.3 稀有鮈鲫ER-LBD序列的获取

对稀有鮈鲫雌激素受体的cDNA序列全长进行conserved domain BLAST分析，找到其LBD区域。对稀有鮈鲫肝脏进行总RNA提取，并反转录成cDNA，利用RT-PCR获取目的基因ERα、ERβ1和ERβ2的LBD序列，引物序列为ERαForward 5’-GCTCGATTCCGCAGTCTCAA-3’，ERαReverse 5’-ACAGCGGCACTCGATTCTTA-3’；ERβ1 Forward 5’-GATGTCACTCACCACCCTCG-3’，ERβ1 Reverse 5’-TCCAAACCAGAGCGTCAGTC-3’；ERβ2 Forward 5’-ACTAATCGCTCGCCTCATGG-3’，ERβ2 Reverse 5’-GGGTGATTAACAGACCGCCA-3’。

1.4 靶质粒的提取纯化与鉴定

10 μL靶质粒pGBKT7-ERα-LBD、pGBKT7-ERβ1-LBD、pGBKT7-ERβ2-LBD转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素或卡纳青霉素抗性筛选阳性克隆，挑取阳性克隆，提取质粒并纯化。0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，同时进行序列测定，测序引物为pGBKT7通用引物。

1.5 构建双杂交荧光酵母

挑取新鲜培养的酵母Y187-Luc菌株单菌落，在25 mL YPDA培养基中30 ℃振荡培养到对数生长期后(600 nm处的吸光度值为0.4～0.6)，根据clontech酵母转化试剂盒将pGBKT7-ERα-LBD质粒和pGAD424-GRIP1质粒同时转染至酵母细胞Y187-Luc，构建ERα-GRIP1双杂交酵母，涂布在SD/-His/-Trp/-Leu营养缺陷型的选择性固体培养基上30 ℃培养2～4 d，挑取能在选择性培养基生长的单菌落接种于SD/-His/-Trp/-Leu液体培养基中，30 ℃、200 r·min-1振荡培养过夜，第2天部分酵母添加15%的无菌甘油后-80 ℃冷冻保存。相同的方法将pGBKT7-ERβ1-LBD质粒和pGAD424-GRIP1质粒，pGBKT7-ERβ2-LBD质粒和pGAD424-GRIP1质粒同时转染至酵母细胞Y187-Luc构建ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1双杂交酵母。

1.6 荧光素酶活性的测定

为了选择对数生长期的酵母，调节菌液在600 nm处吸光值为0.75，在无菌条件下，取995 μL加入5 μL不同梯度的E2和二甲基亚砜(DMSO)，混匀成暴露培养液。将200 μL暴露培养液加入无菌的96孔板中，800 r·min-1、30 ℃下振荡培养4 h，测定OD600 nm(GENios酶标仪，奥地利，Tecan)。从培养板中取100 μL菌液加入100 μL用柠檬酸-柠檬酸钠(pH为3.0)溶解的0.05 mmol·L-1的D-荧光素置于检测白板中，检测荧光值。

1.7 数据处理

对于标准物质E2对ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1双杂交酵母的剂量-效应曲线，采用Origin软件对相对荧光强度与E2浓度进行四参数的Logistic回归拟合，得出半数效应浓度(EC50)值。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 pGBKT7-ER-LBD诱饵质粒的鉴定

将构建的诱饵质粒pGBKT7-ERα-LBD、pGBKT7-ERβ1-LBD和pGBKT7-ERβ2-LBD进行5’EcoRI-3’SalI酶切测序验证，皆为约1 000 bp的载体片段(图1)，具体分别为981、825和960 bp的片段。同时对质粒的测序结果进一步证实，上述质粒正确插入了稀有鮈鲫的ERα-LBD、ERβ1-LBD和ERβ2-LBD基因片段，插入方向及阅读框正确。

图1 pGBKT7-ERα-LBD、pGBKT7-ERβ1-LBD和pGBKT7-ERβ2-LBD诱饵质粒的鉴定Fig. 1 Identification of the bait plasmid of pGBKT7-ERα-LBD, pGBKT7-ERβ1-LBD and pGBKT7-ERβ2-LBD

2.2 稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母剂量-效应关系的建立

将稀有鮈鲫ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1双杂交荧光酵母暴露到不同浓度的E2中，检测诱导产生的荧光素酶活性，建立了E2对荧光素酶活性诱导的剂量-效应关系曲线(图2)。结果表明，E2对稀有鮈鲫ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1双杂交荧光酵母的荧光素酶活性诱导均存在明显的剂量-效应关系，最大效应浓度分别为：5×10-9、5×10-10和7.5×10-10mol·L-1；半数效应浓度(EC50)值分别为1.98×10-9、1.77×10-10和3.52×10-10mol·L-1。本实验构建的双杂交荧光酵母与已报道的E2在重组人雌激素受体ERα双杂交酵母系统中检测的EC50(7.3×10-11mol·L-1)结果类似[9]，表明本实验构建的稀有鮈鲫不同ER亚型的重组荧光双杂交酵母对E2具有较好的灵敏度，也初步证明稀有鮈鲫不同ER亚型的双杂交荧光酵母测评体系构建成功。有文献报道，中国的扬子江、丹水河和太湖中的E2浓度分别可以达到3.8、66.2和15.5 ng·L-1，而类雌激素物质在环境相关浓度(ng·L-1)下可以干扰鱼类的内分泌系统，甚至导致雄鱼的雌性化[10]。故可以将本实验构建的稀有鮈鲫不同ER亚型的重组荧光双杂交酵母应用于环境水体雌激素活性的检测，通过评估对模式生物稀有鮈鲫ER的影响分析水体中内分泌干扰物的潜在环境风险，以期为水质保障和污染治理提供重要依据。

图2 17β-雌二醇(E2)对稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母荧光素酶活性诱导的剂量-效应关系Fig. 2 The induction dose-response curves of rare minnow different ER subtype recombinant fluorescent two-hybrid yeasts by 17β-Estradiol (E2)

比较3株转入稀有鮈鲫不同ER亚型的重组荧光双杂交酵母对E2的剂量-效应关系，发现ERα-GRIP1的EC50>ERβ2-GRIP1的EC50>ERβ1-GRIP1的EC50，表明稀有鮈鲫不同亚型的ER-LBD对E2的亲和力及响应存在差异，ERβ特别是ERβ1对E2的应答更为灵敏。本实验得出的E2诱导稀有鮈鲫ERα和ERβ转录活性的差异与其他硬骨鱼类的相关报道结果一致，利用GAL4-ER-LBD的融合蛋白和ER嵌合蛋白的相互作用量化ER-LBD的反式激活发现，青鳉、三刺鱼、斑马鱼、鲤鱼和拟鲤的ERβ-LBD比ERα-LBD对E2敏感，其中ERβ1较ERβ2对E2更为敏感[1]。根据nER途径中不同分子机制开发的检测方法也得出类似的结果，Tohyama等[11]采用常规的含有ERE报告基因的转录激活实验发现，多鳍鱼和龙鱼的ERβ对E2的转录应答相对ERα较为敏感(多鳍鱼ERβ的EC50=1.12×10-10mol·L-1，ERα的EC50=3.88×10-10mol·L-1；龙鱼ERβ的EC50=8.98×10-11mol·L-1，ERα的EC50=4.13×10-10mol·L-1)，对于鳗鱼的ERβ1和ERβ2，ERβ1较ERβ2对E2更为敏感(ERβ1的EC50=3.93×10-11mol·L-1，ERβ2的EC50=7.64×10-11mol·L-1)。以上研究表明，硬骨鱼类的不同ER亚型对配体诱导的转录激活具有差异性，稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母可以应用于分析不同ER亚型与配体间相互作用的差异。

2.3 稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母专一性的检测

将稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母暴露于不同人体激素包括17β-雌二醇(E2)、双氢睾酮(DHT)、9-顺维甲酸(9-cisRA)、三碘甲状腺原氨酸(T3)和孕酮(PG)中，通过检测荧光素酶活性，考察稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母对不同人体激素的响应情况，结果在10-6～10-11mol·L-1浓度范围内，T3、DHT、PG和9-cisRA对3株稀有鮈鲫重组荧光双杂交酵母的荧光素酶活性几乎没有诱导，而E2对荧光素酶活性存在明显诱导(图3)。因此，E2对稀有鮈鲫ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1荧光双杂交酵母存在专一性诱导。

图3 不同激素诱导稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母的专一性检测注：E2为17β-雌二醇，DHT为双氢睾酮，9-cis RA为9-顺维甲酸，T3为三碘甲状腺原氨酸，PG为孕酮；* 表示P<0.05，与对照组相比。Fig. 3 Specificity detection of different ER subtypes of rare minnow different ER subtype recombinant fluorescent two-hybrid yeasts induced by different hormonesNote: E2 stands for 17β-estradiol; DHT stands for dihydrotestosterone; 9-cis RA stands for 9-cis retinoic acid; T3 stands for triiodothyronine; PG stands for progesterone; * means P <0.05, compared with the control.

综上所述，所构建的稀有鮈鲫ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重组荧光双杂交酵母均能选择性地检测类雌激素物质，E2对荧光素酶活性的诱导均存在明显的剂量-效应关系且它们对E2的亲和力和响应具有差异性，敏感程度排序为：ERβ1-LBD>ERβ2-LBD>ERα-LBD。结果表明，3株重组荧光双杂交酵母有助于理解稀有鮈鲫不同ER亚型功能的差异和在雌激素信号转导中的作用，而且可以将3株重组荧光双杂交酵母应用于识别EDCs中的类雌激素物质，研究稀有鮈鲫不同ER亚型的LBD对EDCs的敏感性，从而分析鱼类接触EDCs的潜在风险；也可以将其应用于环境水体雌激素活性的风险评价，以期为水质保障和污染治理提供重要依据。