叶菌唑对斑马鱼的急性毒性及生物富集效应

李如美，戴争，王维，张霞，郇恒尚，李丹丹，高宗军,*

1. 山东省农业科学院植物保护研究所/山东省植物病毒学重点实验室，济南 250100 2. 南京南农农药科技发展有限公司，南京 210095

随着农药的广泛应用，其对生态环境的破坏也日趋严重，农药污染问题也已经成为全人类广泛关注的重大环境问题。农药环境安全性评价工作已成为农药科学合理施用的基础，同时对保障生态环境安全具有重要的作用[1]。农药在田间施用时，可以通过多种途径进入水生环境，引起水资源污染、水生生态系统破坏和食品安全等一系列问题[2]。鱼类作为生态系统中的重要生物，同时又是人类的主要食物，农药对水生生物的急性毒性和生物富集性与农药的合理施用密切相关，因此，农药对鱼类的毒性评价工作一直是农药环境评价的重点[3]。

叶菌唑(metconazole)作为一种新型三唑类广谱内吸性杀菌剂，可有效防治小麦赤霉病、小麦白粉病以及小麦锈病等禾谷类作物病害，在小麦发病的关键期，化学防治是控制小麦病变的重要手段[4-6]。小麦作为重要的粮食作物，在中国人餐桌上的呈现方式多种多样。因此，评价叶菌唑对非靶标生物的毒性备受关注。目前，关于叶菌唑的研究多集中在小麦病害防治方面[7-8]，但对哺乳动物和非靶标生物毒性作用的研究还相对较少，本研究开展了叶菌唑原药生物富集效应和对斑马鱼(Brachydaniorerio)急性毒性的研究，为更全面评价叶菌唑在环境中的安全性提供依据，以减少农药使用过程中的环境危害。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料

95%叶菌唑原药购自江苏耕耘化学有限公司；助溶剂丙酮购自(分析纯)天津市富宇精细化工有限公司。

斑马鱼(Brachydaniorerio)购买于济南梦幻水景商贸有限公司，染毒前在试验条件下驯化7 d。

试验用水为存放并经活性炭去氯处理24 h以上的自来水。水质硬度为10～250 mg·L-1(以碳酸钙计)，pH为6.0～8.5，并且试验期间变化量在±0.5之间，溶解氧保持在试验温度下饱和值的60%；室内温度为(25±1) ℃。

HQd40便携式pH计(梅特勒-托利多，美国)、HQd40便携式溶解氧测定仪(梅特勒-托利多，美国)、YD-300水质硬度计(上海三信仪表厂，中国)、Agilent1260高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司，美国)、Z326K高速冷冻离心机(HERMLE，德国)、SQP百分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司，德国)、BSA224S-CW万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司，德国)。

1.2 试验方法

1.2.1 斑马鱼急性毒性试验

本试验依据《化学农药环境安全评价试验准则》第12部分：鱼类急性毒性试验[9]，采用半静态法研究叶菌唑原药对斑马鱼的急性毒性效应。设置5个浓度组，叶菌唑浓度分别为3.18、3.50、3.85、4.25和4.66 mg·L-1，并设空白对照组和助溶剂对照组。将试验用鱼放入按浓度配制的水溶液中，每缸5 L水溶液，每组10尾鱼，并保证各组大小一致，每24 h更换一次试验药液，测定溶解氧与pH，记录96 h每个鱼缸中斑马鱼的死亡情况。

1.2.2 斑马鱼富集试验

参照《化学农药环境安全评价试验准则》第7部分：生物富集试验[10]，采用半静态法对斑马鱼生物富集效应进行研究。根据95%叶菌唑原药对斑马鱼急性毒性的96 h-LC50，以其1/100(3.90×10-2mg·L-1)和1/10(0.39 mg·L-1)设置2个处理组浓度，同时设空白对照和溶剂对照。每个处理2次重复，每次重复40条鱼。8 d内每24 h更换试验药液，并于0、24、48、96、144和192 h分别从各处理中取水样与鱼样，对水样与鱼样中供试物含量以及pH、水温和溶解氧含量进行测定，同时观察记录试验鱼中毒症状和死亡数。

1.2.3 仪器分析方法

Agilent1260高效液相色谱仪检测条件：紫外检测器的检测波长为220 nm；流动相为甲醇：水(75∶25，V∶V)，流速为1 mL·min-1；进样体积为20 μL；柱温为30 ℃，色谱柱为SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)。

1.2.4 样品前处理

水样：取20 mL水样于分液漏斗中，加入20 mL二氯甲烷，萃取2次，取下层液体于鸡心瓶中，40 ℃旋转蒸发近干，甲醇溶解定容至1 mL，过0.22 μm有机滤膜，待测。

鱼样：将每个鱼缸中的鱼用0.8% NaCl溶液清洗，于离心管中称重，加入10 mL乙腈，匀浆2 min，按每1 g样品加1 g无水硫酸钠。超声15 min，6 000 r·min-1离心10 min，取上清液于鸡心瓶中。残渣中再加入10 mL乙腈，重复提取一次，合并上清液。50 ℃旋转蒸发近干，甲醇溶解定容至5 mL。用5 mL二氯甲烷和甲醇的混合溶液(V(二氯甲烷)：V(甲醇)=95∶5)活化弗罗里硅土小柱，将定容的5 mL溶液全部加入到柱顶进行净化，用5 mL二氯甲烷和甲醇的混合溶液(V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=95∶5)洗脱2次，收集洗脱液，50 ℃旋转蒸发近干，甲醇溶解定容至1 mL，过0.22 μm有机滤膜，待测。

1.2.5 数据处理

标准曲线的绘制：用甲醇配制0.10、0.50、1.00、2.00、5.00和10.00 mg·L-1叶菌唑系列标准工作溶液按上述条件进样分析，以浓度-峰面积绘制叶菌唑标准曲线，其回归方程为y=44.903x+1.4488 (R2=0.9999)。结果表明，叶菌唑在0.10～10.00 mg·L-1浓度范围内线性良好。

水样中添加回收率测定：分别向试验用水中添加试验农药标准品，使其浓度为0.39和0.039 mg·L-1，每个浓度设置5个重复，采用上述前处理和仪器分析方法，测定试验农药浓度。平均回收率为90.32%～90.96%，相对标准偏差(RSD)为2.25%～3.54%。

鱼样中添加回收率测定：在鱼中添加叶菌唑标准溶液，设0.39 mg·L-1和3.9 mg·L-12个添加浓度，每个浓度设5个平行。平均回收率为91.63%～96.17%，RSD为3.85%～4.84%。

统计分析：斑马鱼急性毒性试验96 h-LC50值以及95%的置信限由统计软件SPSS 18.0计算而得。生物富集系数(BCF)计算公式为BCF=Cfs/Cws，其中，Cfs为平衡时鱼体内的供试物含量，Cws为平衡时水体内的供试物含量。依据《化学农药环境安全评价试验准则》中的标准，判断戊唑醇对斑马鱼的毒性等级与富集效应等级。

2 结果(Results)

半静态试验结果显示，试验过程中空白对照组以及助剂组的斑马鱼与试验开始时相比无明显变化。95%叶菌唑原药对斑马鱼急性毒性的96 h-LC50为3.89 mg·L-1(表1)。95%叶菌唑原药96 h-LC50的1/100试验处理组中，试验结束时(192 h)，鱼体中叶菌唑含量尚未达到平衡，斑马鱼对叶菌唑的生物富集系数(BCF8d)为26.2(表2)。95%叶菌唑原药96 h-LC50的1/10试验处理组中，4 d时水体及鱼体中叶菌唑含量达到平衡，斑马鱼对叶菌唑的生物富集系数(BCF)为53.3(表3)。

表1 95%叶菌唑对斑马鱼的致死率Table 1 The mortality rate of Brachydanio rerio induced by 95% metconazole

表2 95%叶菌唑原药在斑马鱼体中的生物富集性(叶菌唑溶液初始浓度为0.039 mg·L-1)Table 2 The bioconcentration of 95% metconazole in Brachydanio rerio (the original concentration of metconazole is 0.039 mg·L-1)

表3 95%叶菌唑原药在斑马鱼体中的生物富集性(叶菌唑溶液初始浓度为0.39 mg·L-1)Table 3 The bioconcentration of 95% metconazole in Brachydanio rerio (the original concentration of metconazole is 0.39 mg·L-1)

3 讨论(Discussion)

溶剂和助剂本身会对鱼类造成毒性伤害，因此，在农药对鱼类毒性试验中应该尽量避免[11]。本研究选用的助剂为丙酮，急性毒性试验和生物富集试验的溶剂对照组中均未观察到斑马鱼死亡和异常行为，说明丙酮=的影响可以忽略不计。

鱼类生物富集试验对评价农药的环境行为及其慢性危害有十分重要的意义[12]。叶菌唑生物富集试验结果表明，95%叶菌唑原药96 h-LC50的1/100试验处理中，斑马鱼对叶菌唑的生物富集系数(BCF8d)为26.2，95%叶菌唑原药96 h-LC50的1/10试验处理中，斑马鱼对叶菌唑的生物富集系数(BCF)为53.3，依据《化学农药环境安全评价试验准则》[11-12]判断为中等富集性。农药的水溶性和分配系数等与其生物富集性有关联，叶菌唑原药微溶于水，正辛醇-水分配系数较高，因此，其在鱼体内富集作用较强[13]。

本试验结果表明，叶菌唑在斑马鱼体内属于中等富集性农药。因此，田间施用叶菌唑时，需特别注意其施用量、使用范围和使用方法，应尽量避免其在水边使用以减少对鱼类的危害。此外，为了更加系统准确地评价叶菌唑的环境安全性，还需进行其他非靶标生物的毒性试验以及环境归趋试验等[14-15]。