载脂蛋白E对低氧诱导小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及其机制*

郝家乐， 徐立聪， 黄天鹏， 余 艳， 王瑶尧， 范小芳， 龚永生， 毛孙忠

(温州医科大学低氧医学研究所， 浙江 温州 325035)

低氧诱导的肺血管平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMCs)异常增殖是低氧性肺动脉高压重要的病理学特征[1]。本课题组最新的研究发现：低氧诱导肺组织载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)蛋白表达下调参与小鼠低氧性肺动脉高压的形成[2]，研究发现，外源性apoE能抑制血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)介导的平滑肌细胞增殖和迁移[3]，尚不清楚apoE是否对低氧诱导的PASMCs增殖具有抑制作用。本实验在原代培养小鼠PASMCs上，探讨外源性apoE对低氧诱导的PASMCs增殖的影响及可能机制，旨在为低氧性肺动脉高压的发病及防治机制研究提供实验资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

SPF级野生型雄性C57BL/6小鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号SCXK(沪2017-0063)，apoE(人血浆提取物，Sigma公司)，apoE抗体、钙调节蛋白(Calponin)抗体、α肌动蛋白(α-SM actin)抗体、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗体(Abcam公司)，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抗体、磷酸化蛋白激酶C(phosphorylated protein kinase C，p-PKC)抗体(Santa Cruz公司)，GADPH(CST公司)，EdU掺入试剂盒(锐博生物有限公司)。

1.2 PASMCs原代培养

采用组织块贴壁法原代培养小鼠PASMCs[4]：颈椎脱臼法处死小鼠，75%酒精中浸泡5 min。无菌条件下分离肺动脉(含肺动脉主干和左、右肺动脉干)，在外科手术显微镜下尽可能彻底剥除肺动脉外膜，然后纵向剪开，用手术刀片轻轻刮除肺动脉内皮，再将肺动脉中膜剪成0.5～1mm3组织块，以1块/cm2的密度接种于50 ml培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱培养。

1.3 PASMCs鉴定

培养好的细胞用抗α-SM actin抗体和抗Calponin抗体行免疫荧光法显色，α-SM actin和Calponin双阳性细胞为PASMCs。

1.4 PASMCs分组与处理[4]

取3～5代生长状态良好的对数生长期PASMCs，按1×105cells/well接种于6孔板中，贴壁后长至50%融合，无血清处理24 h使细胞周期同步化并随机分为四组：常氧组，常氧+apoE组，低氧组和低氧+apoE组。常氧组培养条件为：1% FBS DMEM/F12，21% O2，5% CO2，37℃；低氧组培养条件为：1% FBS DMEM/F12，1% O2，5% CO2，37℃，外源性加apoE使终浓度为10 μg/ml[5]，培养时间为48 h，重复三次；48 h后检测PASMCs增殖率，apoE、PCNA、PKC以及p-PKC等蛋白表达的变化。

1.5 PASMCs增殖检测

采用EdU掺入法测定细胞增殖(具体步骤参考锐博生物公司试剂盒说明书)：取对数生长期细胞，以每孔 4×103～1×105细胞接种于6孔板中，培养至正常生长阶段。各组细胞加入50 μmol/L EdU培养基500 μl，孵育2 h，然后固定细胞，EdU进行染色(红色)，再对DNA进行Hoechst33342染色处理，荧光显微镜下随机拍摄20个视野，分别计数总的细胞核数(蓝色)与增殖细胞数(紫色)，细胞增殖率=增殖细胞数/总细胞数×100%。

1.6 PASMCs蛋白表达检测

PASMCs中加RIPA裂解液600 μl以制备匀浆。经SDS-PAGE Bio-Rad电泳分离(上样总蛋白量为20 μg)，4℃电转膜过夜，封闭后依次加入apoE(1∶200)、PCNA(1∶500)、PKC(1∶400)、p-PKC(1∶400)和GADPH(1∶2 500)一抗，二抗，选用超敏型化学发光检测试剂盒，置于Bio-Rad凝胶成像分析系统进行曝光、成像。Image Lab 4.0图像分析软件分析处理，以GADPH为内参蛋白，计算目的蛋白与内参蛋白间的相对比值。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 原代培养小鼠PASMCs的鉴定

免疫荧光显示α-SM actin和Calponin阳性细胞，α-SM actin和Calponin双阳性的PASMCs高达97%(图1)。

Fig.1The primary cultured PASMCs were identified by immunocytochemistry (×200)

2.2 ApoE对小鼠PASMCs增殖的影响

常氧组PASMCs增殖率与常氧+apoE组无显著性差异(46.67±3.88vs40.42±1.48，P>0.05)；低氧组PASMCs增殖率较常氧组高64.7%(76.88± 2.09vs46.67±3.88，P<0.05)；低氧+apoE组PASMCs增殖率较低氧组低19.6%(61.83±1.98vs76.88±2.09，P<0.05，图2A，2B)。

Fig.2Effects of apoE on the proliferation of PASMCs induced by hypoxia(×200,n=3)

*P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vshypoxia

2.3 ApoE对小鼠PASMCs的PCNA、PKC和p-PKC蛋白表达的影响

低氧组apoE蛋白表达较常氧组下调51.0%(P<0.05，图3A，3B)。

常氧组PCNA蛋白表达与常氧+apoE组无显著性差异(P>0.05)；低氧组PCNA蛋白表达较常氧组上调69.0%，低氧+apoE组PCNA蛋白表达较低氧组下调19.8%(P均<0.05，图3C，3D)。

各组间PKC蛋白表达无显著性差异，常氧组p-PKC蛋白表达与常氧+apoE组无显著性差异(P均>0.05)；低氧组p-PKC蛋白表达较常氧组上调 120.0%，低氧+apoE组p-PKC蛋白表达较低氧组下调103.2%(图3C，3D，P均<0.05)。

Fig.3Effects of apoE on relative protein expressions of PASMCs induced by hypoxia (n=3)

*P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vshypoxia

3 讨论

ApoE是低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体的配体，通过LDL受体由肝摄取胆固醇酯残粒，对维持血浆胆固醇水平发挥重要作用，是降低血浆中ox-LDL含量和抑制血管壁动脉粥样硬化斑形成的保护因子，与高脂血症和冠心病密切相关，目前主要应用于抗动脉粥样硬化方面的研究。近年的研究表明：肺动脉高压的形成与机体脂质代谢异常关系密切[6-7]。本课题组先近的研究表明：脂质代谢异常参与单纯低氧诱导的小鼠肺动脉高压的形成[8]，最新的研究结果显示：小鼠低氧性肺动脉高压形成与低氧诱导肺组织apoE蛋白表达下调有关[2]。已知PASMCs增殖堆积是低氧诱导的肺血管重塑和肺动脉高压形成的重要因素，抑制PASMCs增殖可改善低氧诱导的肺血管重塑和肺动脉高压[9]。研究发现，作为一种蛋白质因子，apoE还具有抗炎、抗脂质氧化以及抑制PDGF介导的平滑肌细胞增殖和迁移等作用[5,10]，尚不清楚apoE是否对低氧诱导的PASMCs增殖具有抑制作用。

实验结果显示：低氧组PASMCs增殖率较常氧组显著升高，PCNA蛋白显著上调，同时apoE蛋白表达显著下调，提示低氧可诱导PASMCs增殖，低氧诱导PASMCs增殖与apoE蛋白表达下调有关，这与之前在整体动物模型上的研究结果相符[2]。PKC是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，广泛存在于机体的组织细胞内中，是磷脂肌醇信号途径的中心环节，参与多种生理功能的调控，如调节基因表达、细胞增殖和分化、细胞凋亡、细胞迁移等，Dempsey等[11]报告低氧经活化PKC途径诱导PASMCs增殖，Jiang等[12]的研究发现PKCα通过激活ERK1/2途径进而促进低氧诱导PASMCs增殖，本实验结果显示：低氧组与常氧组间PKC蛋白表达无显著性差异，低氧组p-PKC蛋白表达较常氧组显著上调，这与上述的实验结果一致，说明低氧诱导PASMCs增殖与PKC途径活化有关。

值得注意的是，实验结果还显示：apoE组PASMCs增殖率较低氧组显著降低，PCNA蛋白显著下调，同时p-PKC蛋白表达亦显著下调，研究发现，抑制PKC途径可拮抗低氧诱导的PASMCs增殖[13]，提示外源性apoE抑制低氧诱导PASMCs增殖作用可能通过抑制PKC途径活化来实现，其可能的机制与apoE抑制ERK1/2通路有关[14]，具体机制有待进一步阐明。目前，至少发现有13种PKC亚型(不同物种、不同组织细胞中PKC亚型分布不同)，根据激活物的差异分类，α、βI、βII和γ等经典PKC亚型的激活物为Ca2+和甘油二酯，而新颖PKC亚型如ε、θ、η、δ和μ等受甘油二酯激活，非经典PKC亚型如ζ、ι和λ受其它脂质衍生物激活[15]。研究发现，肺血管主要表达PKCα、PKCβI、PKCβII、PKCδ、PKCε和PKCη，低氧通过激活PKCα诱导PASMCs增殖[12]，慢性低氧性肺动脉高压和右心室肥厚的发生与肺血管PKCα、PKCβI、PKCβII和PKCδ表达异常有关，而与PKCε和PKCη无关[16]，apoE是经哪些PKC亚型抑制低氧诱导PASMCs增殖有待进一步的研究。同样的，外源性apoE是否具有改善低氧诱导的肺血管重塑作用，apoE防治低氧性肺动脉高压具体的分子机制有待进一步的探究。

综上所述，apoE能抑制低氧诱导小鼠PASMCs增殖，其可能机制与阻碍PKC途径有关。进一步研究apoE防治低氧性肺动脉高压的作用，不仅有助于扩展对低氧性肺动脉高压发病机制的认识，而且可为低氧性肺动脉高压的防治提供新的思路。