缺血性心肌病大鼠心肌细胞自噬在心肌重塑中的作用*

陈少青， 万 全， 白婷婷， 王春贵， 宣丽颖， 王 羽△， 赵 明△

(1. 内蒙古民族大学附属医院， 通辽 028000； 2. 内蒙古民族大学医学院， 通辽 028000)

缺血性心肌病是慢性冠脉疾病类型之一,主要表现为心室扩大及心力衰竭[1]。其原因是由于长期冠脉缺血导致心肌细胞死亡及纤维组织增生等病理改变引发的心肌重塑。目前认为，在细胞死亡类型中除了坏死和凋亡外，还存在一种Ⅱ型程序性死亡，即自噬。自噬在心脏疾病发展中具有双重作用，在一些情况下，自噬可以降解损伤的细胞器，提供氨基酸及游离脂肪酸，对心肌细胞具有保护作用，但自噬过度激活却对心肌产生损伤[2]。内质网是真核细胞内由动态变化的囊状和管状结构组成的重要细胞器。新合成的膜蛋白与分泌蛋白的折叠与糖基化修饰、脂质的合成以及Ca2+的贮存均在内质网中进行。当各种原因导致内质网稳态失衡时，出现误折叠蛋白在内质网内异常聚集并引起内质网应激性蛋白分泌增加，识别错误折叠蛋白，通过蛋白酶体将其降解，上述一系列反应过程即内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress，ERS)[3]。目前关于缺血性心肌病心肌重塑与内质网应激及自噬相关性报道较少，本研究通过结扎冠状动脉前降支建立缺血性心肌病大鼠模型，观察其大鼠心肌重塑、内质网应激和自噬的相关蛋白的表达情况，探讨缺血性心肌病心肌重塑的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物药品与仪器

GRP78抗体，LC3-I抗体、LC3-II抗体、Beclin-I抗体购自Boster公司，内参β-actin购自wanleibio公司；BL-420生物机能实验系统购自成都泰盟软件有限公司。36只体重180～220 g雄性SD大鼠。

1.2 缺血性心肌病大鼠模型的制备

选体重180～220 g清洁级雄性大鼠36只，随机分为正常对照组、假手术组、缺血性心肌病组，每组12组。正常对照组未进行任何处理；假手术组及缺血性心肌病组大鼠用20%的氨基甲酸乙酯(5 mg/kg)腹腔注射麻醉后，切开颈部皮肤并分离气管，做气管插管与人工呼吸机相连，按肢体标准Ⅱ导连接BL420生理仪记录心电图。呼吸频率60 beats/min，呼吸比率为3∶1，通气量1 ml/g。沿胸骨左缘第二，三肋间隙迅速打开胸腔及心包，暴露心脏，用0/3号缝合线从左心耳下缘1 mm 处进针，于肺动脉圆锥左缘出针，将心脏复位，结扎冠状动脉前降支，关闭胸腔，观察心电图变化，以心电图ST段抬高、T波高尖作为模型是否成功的标志，缺血20 min后，迅速打开胸腔，解开结扎线行再灌注，关胸并记录心电图变化。假手术组大鼠在相同位置只穿线而不结扎冠状动脉。手术结束关闭及缝合胸腔，关闭呼吸机拔出气管插管缝合气管创口及颈部皮肤，从手术日开始每日观察大鼠的一般状态，包括饮食，毛色，活动和排泄情况。

1.3 心脏彩超检测

实验开始第2周、第4周，各组大鼠腹腔注射2% 戊巴比妥进行麻醉，行心脏超声检查心脏结构变化及心脏功能。

1.4 病理取材及切片制作

第4周心脏彩超检查后，立即处死大鼠，在无菌状态下剪开大鼠左肋，去除心包后暴露心脏，取出心脏，将左心室肌组织放入4%多聚甲醛溶液固定，经乙醇脱水，石蜡包埋，切片，将心肌切片脱蜡、二甲苯透明，行HE、masson染色，于光镜下观察病理变化。同时取左心室组织放入4%戊二醛溶液固定，准备行电镜观测超微组织变化。

1.5 Western blot检测各组小鼠心肌细胞GRP78、LC3-I、LC3-II、Beclin-I表达

采用RIPA裂解液提取各组大鼠心肌细胞蛋白质后，配置10%SDS-PAGE蛋白胶后，加样并跑胶，跑胶程序设置为90 V 进行15 min后，150 V进行1 h，应用半干转膜仪进行转模， 5% BSA 37℃封闭1 h后，加入一抗GRP78(1∶1 000)，LC3-I(1∶ 1 000)，LC3-II(1∶1 000)，Beclin-1 (1∶1 000)，4℃孵育过夜后，次日PBST洗膜3次每次10 min后，二抗37℃孵育1 h，PBST洗膜3次每次10 min。ECL显影检测小鼠心肌细胞内质网应激相关蛋白GRP78与自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II、Beclin-I表达。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠精神、饮食、活动、毛色及死亡数量的变化

对照组及假手术组大鼠毛发光亮，体质量随时间增加，缺血性心肌病组大鼠毛发灰暗，体质量有所减轻，3组大鼠饲养及实验过程中均未出现死亡。

2.2 各组大鼠心脏彩超变化

对照组及假手术组大鼠手术后2周及4周心脏超声检查心脏结构及功能未见明显改变，与对照组及假手术组比较，缺血性心肌病组大鼠手术后2周及4周心脏超声检查心室扩大，EF值降低(图1，表1)。

Fig.1Heart color Doppler ultrasound images of each group

A: Control group; B: Sham-operated group; C: Ischemic cardiomyopathy group (2 week); D: Ischemic cardiomyopathy group (4 week)

GroupEF%Control85±3Sham-operated82±4Ischemic cardiomyopathy (2 week)71±6∗∗##Ischemic cardiomyopathy (4 week)64±2∗∗##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vssham-operated group

2.3 光镜下心肌组织的变化

HE染色显示：对照组与假手术组没有明显区别，与对照组大鼠比较，缺血性心肌病大鼠出现心肌纤维排列紊乱，心肌间质水肿；masson染色显示：对照组与假手术组没有明显区别，与对照组大鼠比较，缺血性心肌病大鼠心肌纤维明显增生(图2，见彩图页Ⅱ)。

2.4 心肌组织超微结构改变

对照组与假手术组没有明显区别，对照组大鼠心肌电镜下肌节完整，线粒体清晰，心肌纤维排列整齐，缺血性心肌病大鼠线粒体空泡化严重，心肌纤维排列紊乱，肌节完整性受损(图3)。

Fig.3Transmission electronic microscope images of rat cardiomyocyte

A: Control group; B: Ischemic cardiomyopathy group

2.4 Western blot检测各组大鼠心肌细胞GRP78、LC3-I、LC3-II、Beclin-I表达变化

对照组与假手术组没有明显区别，与对照组及假手术组大鼠比较，缺血性心肌病组大鼠心肌GRP78、Beclin-I、LC3-II /LC3-I比值表达明显增加(P<0.01，图4，表2)。

Tab. 2 The expressions of GRP78, LC3-I, LC3-II and Beclin-I in rats’ heart of each group n=12)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSham-operated group

Fig.4The expressions of GRP78, LC3-I, LC3-II and Beclin-I in rats’ heart of each group

3 讨论

当今，我国生活水平逐步提高，冠心病的发病率及由冠心病所致心力衰竭的发病率越来越高，而缺血性心肌病是慢性冠脉疾病类型之一。目前缺血性心肌病已成为全球常见影响生命的主要疾病。

本实验采用结扎冠状动脉前降支建立大鼠缺血性心肌病模型，以心电图ST段抬高、T波高尖作为模型是否成功的标志，缺血20 min后，迅速打开胸腔，解开结扎线行再灌注，关胸并记录心电图变化。模型建立成功后，超声心动图检测各大鼠心功能，发现心脏超声检查心室扩大，EF值降低。病理检测发现缺血性心肌病大鼠心肌损伤，心肌纤维化明显，说明缺血性心肌病大鼠有明显的心肌重塑现象。电镜观察缺血性心肌病大鼠心肌超微结构出现线粒体空泡及肌纤维排列紊乱及断裂，心肌缺血、缺氧后心肌细胞线粒体受损，影响心肌细胞氧化磷酸化， ATP产生减少，引发心肌细胞死亡及纤维组织增生。文献报道ATP产生减少可能引发内质网应激[4]。葡萄糖调节蛋白78KD(GRP78)是热休克蛋白家族中的一类，是一种多功能钙离子结合蛋白，参与细胞内蛋白质的折叠、转运和降解[5]。GRP78是内质网应激的分子伴侣，实验发现缺血性心肌病大鼠心肌中GRP78蛋白表达增高，说明缺血性心肌病与内质网相关。自噬在心血管疾病中具有重要作用。目前大部分研究认为自噬是内质网应激条件下误折叠蛋白促进细胞存活的机制；通过促进未折叠蛋白的清除、清除受损伤的线粒体或者内质网，自噬可以恢复细胞的稳态，促进细胞存活[6-8]。大量临床研究证实，自噬参与心力衰竭的发生发展过程[9]。研究显示，Bcl-2相互作用蛋白(Beclin-1)过表达的小鼠心肌细胞中自噬活动增加，心功能降低，LC3是哺乳动物细胞中酵母Atg8基因的同源物，被认为是自噬小体的标志分子[10]。本实验观察了自噬与缺血性心肌病的关系，发现Beclin-I、LC3-II /LC3-I比值表达明显增加，证明自噬与缺血性心肌病有重要关系。

综合文献报道及本实验结果，可以推测缺血缺氧引发心肌细胞内质网应激，内质网应激导致细胞自噬增加，吞噬受损的线粒体及清除内质网未折叠蛋白，帮助细胞稳态的恢复，促进心肌细胞存活。但在心肌细胞缺血缺氧时，内质网应激与自噬哪一个是启动因子以及具体触发机制目前尚不清楚，有待于在以后的实验中明确。