杭白菊提取物对异丙肾上腺素诱导小鼠心肌肥厚的影响*

吴颖旭， 程杰坤， 李 乐△， 陶厚权

(1. 浙江工业大学药学院本科药剂14级； 2. 浙江工业大学药学院， 杭州 310014； 3. 浙江省人民医院中心实验室， 杭州 310014)

病理性心肌肥厚(cardiac hypertrophy,CH)是心脏对各种病理有害刺激如心肌缺血、高血压等适应性反应的结果；如CH持续进展，则加大心肌耗氧量，促进心肌纤维化和功能损害，诱发心力衰竭、猝死[1]。所以，积极有效防治病理性CH临床价值重大。

杭白菊属“浙八味”药材之一，其能舒张血管、抗氧化、抑制血管平滑肌增生和凋亡；杭白菊总黄酮是其重要活性成分,可对抗心肌缺血,清除氧自由基,降血压[2]；70年代发现其制剂对心纹痛有效率达83.0%[2]。但杭白菊提取物(chrysanthemum flower extract，CFE)防治CH国内外未见报道。本实验用异丙肾上腺素(isoprenaline,Iso)构建CH小鼠模型，观察CFE影响CH作用及机制，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物, 药品与试剂

JCR小鼠，清洁级，雄性48只，体重(19.4±2.6)g，购自浙江省实验动物中心，批号：SCXK(浙)2016-0014。CFE，本研究所植化室提取并鉴定(总黄酮含量≥60%)；盐酸Iso注射液(上海禾木制药有限公司，171209)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)及总超氧化歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、蛋白定量试剂盒-南京建成生物工程研究所；Angiotensin(AngⅡ) ELISA 试剂盒(201708)和Cyclic adenosine monophosphate(cAMP)ELISA 试剂盒(201708)-上海哈灵生物科技有限公司。

1.2 主要仪器

RJ-酶标仪(美国BD 公司)；722N分光光度计(上海精密科学仪器公司)；KDC-2046低温离心机(中科大创新股份有限公司)；Qwin图像分析软件(德国Leica)。

1.3 动物分组及处理

健康雄性JCR小鼠48只，随机分为4组(n=12): 对照组、单纯药物处理组(CFE组)、CH模型组(Iso组)和 CH模型+药物处理组 (CFE+Iso 组)；Iso 组和CFE+Iso 组每天一次i.hIso(3 mg/kg)，以构建小鼠CH模型，对照组和 CFE组每天一次i.h同体积生理盐水，连续14 d；同时i.h在4 h后，CFE组和 CFE+Iso组每天一次灌胃CFE(200 mg/kg) ，对照组和Iso 组每天灌胃同体积的生理盐水；28 d后取小鼠心脏， 检测全心质量指数(heart mass index, HMI)、左室质量指数(left ventricular mass index, LVMI)、心脏质量/胫骨长度比值(heart weight/tibia length, HW/TL)、心肌纤维化程度、心肌SOD、GSH、MDA水平和左心室组织环磷酸腺苷(cAMP)、血管紧张素II(Ang II)水平。

1.4 心肌组织学参数检测

测定各组小鼠体质量后处死，取小鼠心脏及右下肢胫骨, PBS 漂洗，滤纸吸干，分别测体质量、全心质量、左室质量及胫骨长度，计算全心质量指数(heart mass index，HMI)=全心质量/体质量(mg/g)，左室质量指数(left ventricular mass index， LVMI)=左室质量/体质量(mg/g)，心脏质量/胫骨长度(heart weight/tibial length， HW/TL)比值。

1.5 心肌纤维化程度的检测

小鼠左室4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，Masson 染色拍照，Qwin软件分析各组心肌纤维化程度。

1.6 左室组织 T-SOD、GSH 和 MDA 水平检测

取左室称量剪碎，加冷生理盐水成10% 组织匀浆，4℃ 3 000 r/min，离心10 min 得上清液。分别按试剂盒说明书检测上清液中T-SOD、GSH 和MDA 水平。

1.7 左室组织 cAMP和Ang Ⅱ含量的检测

用 ELISA 法测10% 左室匀浆上清液cAMP和 AngⅡ含量，考马斯亮蓝法测上清液总蛋白含量。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠组织学指标比较

与对照组比较，Iso组小鼠 LVMI、HMI 和 HW/TL升高(P<0.01)，而CFE处理后，降低CFE+Iso组小鼠的 LVMI、HMI 和 HW/TL 值(P<0.01);与对照组相比，CFE组小鼠的 LVMI、HMI 和HW/TL 值无显著差异(表 1)。

GroupLVMI(mg/g)HMI(mg/g)HW/TL(mg/mm)Control3.02±0.233.93±0.275.85±0.33CFE3.05±0.243.92±0.295.85±0.25Iso model4.89±0.28∗∗5.86±0.36∗∗8.28±0.38∗∗CFE+Iso4.28±0.25∗# 5.32±0.32∗∗#6.67±0.30∗∗##

LVMI: Left ventricular mass index; HMI: Heart mass index; HW/TL: Heart weight/tibial length

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIso model group

2.2 各组小鼠心肌纤维化程度比较

Masson染色，与对照组比较，Iso 组小鼠心肌纤维化程度明显(P<0.01)，而CFE处理后，CFE+Iso组小鼠心肌纤维化程度下降(P<0.01);与对照组比较，CFE组小鼠心肌纤维化程度无明显变化(图1)。

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsIso model group

2.3 各组小鼠心肌组织氧化应激指标比较

与对照组比较，Iso组小鼠心肌GSH、 SOD 水平下降，MDA水平增加；而CFE处理后，明显改善CFE+Iso组的上述指标(P<0.01);与对照组比较，CFE组小鼠上述指标均无明显差异(表 2)。

GroupGSH(μmol/mg·prot)MDA(mmol/mg·prot)T-SOD(mmol/mg·prot)Control6.21±0.924.56±0.69158±31CFE6.23±0.894.60±0.71161±33Iso model 5.02±0.67∗∗6.43±0.86∗∗73±17∗∗CFE+Iso 5.79±0.72∗#4.99±0.72∗##119±24∗∗##

GSH: Glutathione； MDA: Malondialdehyde； T-SOD: Total-superoxide dismutase

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P< 0.01vsIso model group

2.4 各组小鼠心肌cAMP 和 AngⅡ含量比较

与正常组比较，Iso模型组 cAMP 和AngⅡ含量均增多(P<0.01，表3)。与Iso模型组比较，CFE+Iso组的上述指标降低 (P<0.01或P<0.05)。

GroupcAMP(nmol/mg·prot)AngⅡ(pg/mg·prot)Control1.74±0.3183.12±12.53CFE1.75±0.30 5.85±0.25Iso model 2.48±0.39∗∗95.72±13.02∗CFE+Iso1.77±0.31##79.38±10.51#

CFE： Chrysanthemum flower extract

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIso model group

3 讨论

Iso加强心肌收缩力，增多心肌耗氧量，增加心肌蛋白合成而诱导CH[3]。本研究显示，CFE处理后，CFE+Iso组小鼠LVMI、HMI 和 HW/TL 值下降,说明CFE预防性给药对Iso诱导CH有保护作用。心肌纤维化是心肌重构诱发心衰和猝死的重要高危因素[1]，预防性给予CFE后，CFE+Iso 组小鼠心肌纤维化程度明显下降。提示，CFE能有效抑制Iso 所致心肌纤维化发展。

研究证实，氧化应激损伤与CH发病密切相关，当机体活性氧自由基的产生和抗氧化系统失衡时，氧化应激损伤就易发生；当体内 SOD、GSH等抗氧化物质减低时，诱发脂质过氧化， 促使MDA 堆积，参与CH进程[4]。本研究发现， CFE处理后，CFE+Iso 组小鼠SOD,GSH和MDA指标水平翻转， 提示CFE提高机体抗氧化能力，缓解Iso诱导小鼠心肌损伤。

基础与临床研究已公认，交感神经系统过度兴奋能导致心肌cAMP增加，最终造成CH、纤维化；也能促进肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS) 活化，分泌Ang II；Ang II 可与心肌细胞膜上血管紧张素II受体结合，活化 G蛋白激活磷脂酶 C，产生三磷酸肌醇和二酰基甘油；前者释放细胞内 Ca2+，后者激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，PKC转入核内再激活PLC-PKC/MAPK 家族等多种信号级联反应,引发细胞增殖，导致CH[5]。本研究中，CFE+Iso组小鼠心肌cAMP、AngⅡ含量不同程度下降。显示CFE能降低心肌交感神经、RAAS 兴奋性，有效对抗CH。

综上所述，本研究观察到CFE能改善Iso 诱导的小鼠CH的心脏状况，其机制可能与抗氧化、抑制心肌纤维化进展、降低心肌cAMP、AngⅡ水平有关，为CFE用于CH的临床研究提供动物实验的研究资料。