血清泛素在食管鳞癌中的表达及临床意义

徐依人，刘鹏飞，贾慧敏，高 昳，王芳军，沈卫东，李腾飞

0 引 言

食管癌早期诊断率低、预后不良等特征成为了健康的巨大威胁［1-2］。目前确诊食管癌以胃镜检查与病理结果为主，临床上与食管癌相关的血清筛查指标较少，主要包括鳞状细胞癌抗原（serum squamous cell carcinoma antigen，SCC）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）。然而，单一指标诊断价值有限［3-4］。故需要更高灵敏的筛查指标以提高食管癌检出率。

泛素（ubiquitin，UB）是一种可共价结合并修饰细胞内多种蛋白质的小分子蛋白［5］。有研究表明，UB在结肠癌［6］、宫颈癌［7］及肝癌［8］等多种肿瘤组织中异常高表达。本课题组前期研究发现UB基因在肺癌细胞中明显高表达，下调UB的表达可促进肺癌细胞的凋亡，从而抑制其增殖，并提高放射敏感性［9］。然而目前UB在食管癌中的表达情况及功能尚不明确。本研究以血清UB为切入点，研究其在食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中的表达与临床病理特征的相关性，为ESCC的诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1研究对象选取2018年2月至2019年5月我院收治的88例ESCC患者作为研究对象。纳入标准：均经病理学检查确诊为食管癌；均未接受过放疗、化疗及靶向治疗；女性均为非妊娠期。排除标准：合并其他恶性肿瘤；合并自身免疫系统疾病；合并严重肝功能不全；合并精神类疾病。88例ESCC患者中，男71例、女17例，平均（67.36±0.97）岁。临床分期根据内镜检查、影像学检查、术后病理结果等，按照AJCC第八版指南综合判定。结果显示，本组纳入Ⅰ期16例，男12例、女4例，平均年龄（71.44±2.68）岁；Ⅱ期24例，男19例，女5例，平均年龄（67.79±2.13）岁；Ⅲ期31例，男25例，女6例，平均年龄（65.55±1.43）岁；Ⅳ期17例，男15例，女2例，平均年龄（66.24±1.60）岁。ESCC患者均于治疗前采集外周血标本，并收集ESCC患者的SCC、CEA等临床资料。另选取同时期在南通大学附属江阴医院进行食管癌筛查的40例胃镜下无明显异常者作为对照组，其中男33例、女7例，平均（65.25±0.85）岁，胃镜检查后采集外周血标本。本研究通过南通大学附属江阴医院伦理委员会批准［批件号：（2018）伦审研第（002）号］，受试者均签署知情同意书。

1.2血清UB、SCC、CEA水平测定抽取患者晨起空腹静脉血5 mL，静置20 min后以3000×g离心力离心5 min，分离血清，收集后置于-80℃冰箱内保存。采取ELISA法检测血清UB水平。试剂盒（Human Ubiquitin ELISA Kit）由武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司提供，按试剂盒说明说进行检测，主要步骤包括：稀释样品、酶标板孵育、生物素化抗体孵育、洗涤、酶结合物抗体孵育、洗涤、底物反应、终止反应、酶标仪450 nm处检测A值。采取电化学发光法测定SCC与CEA。

1.3统计学分析采用GraphPad Prism7.0、SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以（xˉ± s）表示，两组间比较采用t检验，多组数值间比较采用单因素方差分析。采用Logistic回归建立联合检测新变量，并绘制ROC曲线。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1血清UB在ESCC患者中表达ESCC患者与对照组年龄、性别间差异均无统计学意义（P＞0.05）。UB 差异有统计学意义［（41.96±3.273）ng/mL vs（80.86±7.99）ng/mL，P＜0.05］。

2.2血清UB与ESCC患者临床病理特征关系88例ESCC患者中，男性患者血清UB表达水平高于女性患者，年龄＜60岁患者血清UB表达水平高于年龄≥60岁患者，但差异均无统计学意义（P=0.0737、P=0.4118）。肿瘤不同位置、肿瘤局部浸润程度与血清UB表达水平间差异无统计学意义（P=0.4214、P=0.081）。伴淋巴转移患者血清UB水平与无淋巴转移患者比较，差异有统计学意义（P=0.0165）。TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期患者血清UB水平显著高于Ⅰ-Ⅱ期患者，差异有统计学意义（P＜0.001）。见表1。

2.3诊断ESCC效能比较血清UB单独诊断ESCC的灵敏度和ROC曲线下面积均大于SCC与CEA，两两比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）；三者单独诊断ESCC的特异度相近，两两比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。UB、SCC、CEA对应最大约登指数处 Ct值分别为 46.65、1.25、2.85。对血清 UB、SCC、CEA蛋白水平进行Logistic回归，得到各组预测因子回归模型Y=1/［1+EXP（截距+BUB×UB+BSCC×SCC+BCEA×CEA）］，最终得到一个新指标Y代表联合检测。结果显示联合指标诊断ESCC的灵敏度为76.1%、特异度为72.5%，ROC曲线下面积为0.795（95%CI：0.714～0.875），AUC值明显高于各指标单独诊断。见图1，表2。

表1 本组食管鳞癌患者血清UB与ESCC临床病理特征的关系（ng/mL）Table 1 Associationbetween serum UB and clinicopathological characteristics of ESCC patients（ng/mL）

图1 UB、SCC、CEA联合诊断ESCC的ROC曲线Figure 1 ROC curve estimating combined detection performance in the diagnosis of ESCC

表2 UB、SCC、CEA以及三者联合诊断ESCC的效能比较Table 2 The effectiveness of UB,SCC,CEA and the three combined diagnosis of ESCC

3 讨 论

泛素-蛋白酶体系统参与几乎所有的细胞调控过程，如细胞周期、细胞凋亡、信号传导、细胞增殖与分化、蛋白质转运、内质网调控等［10］。在多种良性及恶性肿瘤组织中，如结肠癌［6］、宫颈癌［7］、肝癌［8］等，可发现UB过表达。最近一项研究显示，通过下调泛素基因UBB的表达，在若干体外培养的细胞株中，尤其是对乳腺癌细胞、前列腺癌细胞具有促进凋亡作用［11］。同时Shirahashi等［6］研究表明，UB 在结肠癌组织中表达水平与肿瘤浸润深度、血液及淋巴管转移相关。除可在组织中检测到UB外，正常血清中也包含低水平的UB［12］。在个体受到外伤、多种自身免疫性疾病时，血清UB水平会显著增高2～30倍［13-14］。Zhang J等［15］研究显示，血清UB会引起肿瘤标志物的上调以及免疫细胞数量的减少，从而降低肿瘤细胞的凋亡率，促进肿瘤的发生进展和转移。此外，Steagall R J等［16］发现血清UB通过增加血管调控因子VEGF-A和MMP-2的蛋白表达水平，导致微血管的增生，从而形成有利于肿瘤生长的微环境。尹博等［17］研究证实，食管癌血清中确实有较高的VEGF水平，且与食管癌淋巴转移、TNM分期相关。因此推测血清UB与食管癌存在密不可分的联系。

本研究采用ELISA法发现ESCC患者血清UB水平明显高于对照组，从而推断UB可能与肿瘤的发生有关。在食管癌变的过程中肿瘤细胞会向血液释放更多的游离UB。通过分析UB与ESCC临床特征的相关性，发现其表达水平与患者年龄、性别、肿瘤位置、浸润深度无关，而在淋巴转移、TNM分期中差异具有统计学意义。Ⅲ-Ⅳ期患者血清UB水平与Ⅰ-Ⅱ期患者相比呈现跨越式增长，这说明UB与食管癌的进展密切相关，故可作为一项预测肿瘤恶性程度的指标。

本研究中UB单独检测ESCC的灵敏度为65.9%，特异度为70.0%，灵敏度明显高于SCC与CEA，特异度略低于两者。结合AUC结果提示UB作为筛查指标整体上优于SCC与CEA。CEA作为消化系统肿瘤标志物，其外周血浓度易受肝脏降解影响［4，18］。SCC存在于鳞癌细胞的细胞质中，对于宫颈癌的检测敏感性较高［19］，其次为肺鳞状细胞癌、食管鳞癌［20］。肿瘤指标SCC、CEA在诊断ESCC时，实验临界值低于临床临界值，考虑与样本量范围较局限有关。UB、SCC、CEA联合诊断ESCC时，灵敏度上升至76.1%，特异度为72.5%，在不影响特异度的同时，明显提高了食管癌的检出率，优于既往研究中其他联合指标的诊断率［21-22］。

本研究也存在不足之处。研究时间较短；未能纳入患者的治疗及预后情况；缺乏UB与食管癌患者的治疗、预后之间的关系。这些将在今后的研究中加以明确。

综上所述，血清UB与食管癌的进展密切相关。其简单、便捷、快速、高灵敏度的特点在食管癌的筛查诊断中具有较高的临床价值。其上游调控基因在后续研究中是否可作为食管癌的潜在治疗靶点值得进一步研究发现。