细胞自噬在脂氧素A4治疗大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的作用

尉 娜，常耀辉，路 坦

0 引 言

脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII）是一种特殊类型的脊髓损伤，一旦出现，给患者和家庭带来了沉重的经济和心理负担，因此寻找一条理想的治疗SCII的方案是研究重点［1］。本课题组在前期的研究中已经证明了脂氧素A4（Lipoxin A4，LXA4）可以通过抑制炎症反应和细胞凋亡方面对大鼠脊髓损伤起到了保护作用，认为LXA4可以作为中枢神经系统保护剂［2］。细胞自噬是存在于真核细胞生物中特有的现象，是一种机体内部的适应性机制，在受到外界的刺激，如缺氧、应激、营养缺失等情况下，通过溶酶体吞噬降解受损的细胞器及大分子物质等，达到维持机体的稳态，起到保护细胞的作用，又被认为是一种“自食（self-eating）”现象［3-4］。本实验拟通过检测细胞自噬相关蛋白在3组模型中脊髓组织的表达，研究细胞自噬在脂氧素A4治疗大鼠缺血再灌注损伤模型中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物48只成年雄性SD大鼠，体重180～220 g，雌雄不限，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。饲养环境：温度24℃，相对湿度50%，保持通风，自由食水。

1.1.2实验试剂及仪器脂氧素A4购自美国Cayman公司，Anti-LC3 B antibody购自美国Abcam公司，抗γ-氨基丁酸受体A相关蛋白（γ-aminobutyric acid type A receptor associated protein，GABARAP）、antibody购自美国Abcam公司，PVDF转印膜购自美国Merck Millipore公司，ECL化学发光试剂盒购自美国Merck Millipore公司，RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，多功能全波长扫描酶标仪购自美国Thermo Multiskan公司，倒置显微镜购自日本Nikon公司。

1.2实验方法

1.2.1构建大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型将48只大鼠按随机数字表法分为LXA4组、缺血再灌注组、假手术组，每组16只。假手术组大鼠只暴露腹主动脉，其他两组大鼠平卧于实验台上，无菌消毒铺无菌巾后，腹正中线切口，暴露腹主动脉，仔细游离左肾动脉开口上端水平及左、右髂总动脉分叉水平的腹主动脉，无创动脉夹夹闭腹主动脉上、下端，完全阻断血流30 min后放开，确认远端恢复血流后逐层关腹。术中尾静脉注射肝素盐水抗凝，用烤灯维持体温。术后肌注青霉素预防感染，正常进食水。LXA4组：在关腹后30 min脊髓鞘内注射10 μL LXA4（300 pmol）［2］；缺血再灌注组：在关腹后 30 min脊髓鞘内注射等渗盐水（0.1 mL/kg）；假手术组：不注射药物。

1.2.2 LC3B荧光染色3组大鼠分别于各组处理24 h分别处死，取L2-L5脊髓节段经切片后经相同固定液在4℃固定过夜，石蜡固定。切片于二甲苯中进行脱蜡，随后切片分别浸泡在100%、95%、70%的乙醇中进行水化，取出后使用去离子水冲洗切片，然后浸泡在抗原修复工作液中修复10 min，等冷却后用PBS洗3次，再加入封闭液室温封闭30 min，加入一抗，4℃避光过夜，取出后PBS液冲洗3遍，加入稀释后二抗的室温避光孵育1 h，将含DAPI的封片剂加到载玻片上，盖上盖玻片，室温避光静置10 min，封固后4℃保存待检。使用激光共聚焦显微镜对切片进行观察。LC3B在细胞质中表达，呈现绿色，细胞核由DAPI染色成蓝色，绿色和蓝色荧光共同定位的是自噬阳性细胞。每张切片在10×10倍视野下随机选取6个视野，对绿色和蓝色共同定位的细胞进行计数，即为自噬阳性细胞数。

1.2.3 Western blot检测脊髓组织的脂氧素受体（FPR2/ALX）蛋白的表达大鼠分别于再灌注24 h后处死并取出腰段脊髓，加入预冷的裂解液，充分研磨后离心半径13.5 cm，13 000 r/min，4℃离心10 min，取上清，转移至新的离心管中置于冰上待用。依照标准曲线计算出样品的蛋白浓度，将上样缓冲液放入等量蛋白样品中，97℃加热6 min变性，室温冷却离心后上样。采用电转仪将蛋白从分离胶转移至PVDF膜上，转膜完成后，取出PVDF膜，将PVDF膜放入封闭液（TBST或5%脱脂牛奶）中，室温封闭30 min。加入一抗（用封闭液稀释），室温孵育1 h或4℃杂交过夜。加入适当比例稀释的二抗，室温孵育1 h，取等体积混合均匀的ECL中的A、B液，滴在PVDF膜上，孵育1 min后暗室显影。

1.3统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差（xˉ±s）表示。多组间均数比较用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 LC3B的荧光染色缺血再灌注组（399.80±18.46）和 LXA4组（240.80±12.76）的 LC3B 阳性细胞数 较 假手术组（73.40±19.42）明显升高（P＜0.05），LXA4组较缺血再灌注组阳性细胞数明显减少（P＜0.05）。见图1。

2.2 Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、GABARAP蛋白的表达缺血再灌注组及LXA4组大鼠的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、GABARAP的表达较对照组明显增高（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，LXA4组脊髓组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显下降（P＜0.05），但GABARAP的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、图3。

图1 镜下观察各组LC3B阳性细胞数量（×100）Figure 1 LC3B fluorescence staining of three groups（×100）

图2 各组大鼠脊髓组织的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达Figure 2 The LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ expression of spinal cord in three groups

图3 Western blot检测各组大鼠脊髓组织中GABARAP蛋白的表达Figure 3 The GABARAP expression of spinal cord in three groups

3 讨 论

细胞自噬既是一种正常生理过程，也是疾病的发生和发展中的重要一环［5］，细胞自噬对于机体维持机体稳态是一把“双刃剑”，一方面，自噬过程可以清除受损细胞器和异常蛋白的作用，起到维持机体稳态的作用，即促存活机制［6］；同时也发现过度的细胞自噬超出了维持稳态的极限［7-9］，过度清除了正常的细胞器，导致细胞死亡，即“自噬性程序性坏死”。目前细胞自噬对于机体的作用及机制仍存在着争议，需研究人员深入的研究和探讨。大量研究表明细胞自噬也在神经系统中起到重要作用。譬如中枢神经退行性疾病的主要病理生理特点是蛋白质的异常蓄积或者异常蛋白质的发生，细胞自噬可以帮助机体清除异常蓄积的蛋白质或异常蛋白质，避免这些蛋白质对中枢神经系统造成的损伤［10-11］。在中枢神经损伤方面，有研究体外培养脑神经元细胞［12］，给予氧糖剥离24 h后体外模拟缺血缺氧状态，发现神经元细胞凋亡明显增加，给予一种细胞自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤，3-MA）处理后可以明显减轻神经元损伤，因此认为细胞自噬在中枢系统损伤中也存在着作用。

如何检测细胞自噬现象是研究自噬的基础，目前常用的细胞自噬检测主要分为静态检验和动态检验。静态检验目前应用较为广泛是检测细胞自噬相关基因（autophagy related gene，Atg），在哺乳动物中，Atg6、8研究最多，其中常用的Atg6蛋白包括了Beclin-1蛋白，而Atg8包括了微管相关蛋白3（Microtubule-associated protein light chain3，LC3）、γ-氨基丁酸受体A相关蛋白（γ-aminobutyric acid type A receptor associated protein，GABARAP）等。LC3是已知的唯一一种与吞噬泡膜、自噬体膜和自噬溶酶体膜均有关联的蛋白质。在哺乳动物中，LC3均分为LC3A、LC3B、LC3C 3种亚型，而每一种亚型均有Ⅰ、Ⅱ两种形式，但只有LC3B被证明与细胞自噬有关［13］。当发生细胞自噬时，LC3B-Ⅰ与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺结合成膜结合形式，即为自噬体相关形式LC3B-Ⅱ，LC3B-Ⅱ位于自噬体膜上，其含量多少可以用于检测自噬体的数量［14］，LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的转化是介导自噬体形成的重要步骤［15］，因此LC3B-Ⅰ与LC3B-Ⅱ的比值可以反映LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ动态变化的过程。本研究发现当给与LXA4后LC3B-Ⅱ阳性细胞数量较缺血再灌注组明显下降。但细胞自噬是一种高度动态的过程，而通过免疫荧光检测LC3B-Ⅱ标记阳性细胞数量仅仅为静态检测过程，只是反应在一个特定时间点上的自噬体形成的情况，为了能动态观察细胞自噬的过程，本研究应用Western blot检测LC3B-Ⅱ和LC3B-Ⅰ蛋白含量的比值，发现在SCII发生时自噬流发生，而给与LXA4后自噬流收到抑制。

GABARAP是另一种酵母Atg8的哺乳类同族，是GABAA受体结合蛋白，相对分子质量为16 000。最近的研究发现GABARAP与LC3一样具有与自噬体结合的能力［16］。在 Hironori等［17］研究中，体外培养脊髓运动神经元细胞，并给予缺血再处理，发现了缺血再处理是细胞自噬发生的诱发因素，并发现GABARAP蛋白表达与细胞自噬有密切相关性，也提示了GABARAP也可以作为细胞自噬的标记蛋白用于观察细胞自噬的发生。

在本研究中通过对LC3及GABARAP的检测说明当脊髓受到缺血再灌注损伤时可以诱发细胞自噬，细胞自噬也是SCII的一种损伤机制，这与国内外相关报道一致［18］。此外我们发现当给予LXA4治疗后细胞自噬相关标记蛋白出现下降趋势，说明细胞自噬在SCII接受LXA4治疗后24h受到抑制，这与国内的研究相似［19］。这种现象可能的发生机制是：在SCII时，诱导细胞自噬过度发生，过度的自噬可以对脊髓中的神经元细胞造成损伤［20］，出现神经损伤症状，并且阻碍了轴突的再生能力，当给予LXA4后，一方面脂氧素A4可以抑制SCII的过度发生，避免了过度的细胞自噬，也减轻了过度自噬对神经细胞造成的损伤；另一方面LXA4直接抑制了细胞自噬的发生，但不是完全清除自噬，这样既保留了细胞自噬清楚受损细胞器的功能，也减轻了保护过度自噬造成的损伤。因此我们认为细胞自噬到底在SCII方面起到的是保护作用还是损伤作用，是取决于自噬发生的量，在一定范围内的细胞自噬通过清除脊髓内的有害物质可以达到保护脊髓的作用，但一旦过度，其清除范围超出了保护的限度，会造成脊髓的进一步损害。但这些均是基于动物实验的假设，并没有充足的证据，需要进一步研究探讨。