雷公藤甲素联合脉冲射频疗法对脊神经结扎大鼠Wnt/β-catenin信号通路及其炎性因子的影响

郭 刚，李长文，王文辉，陈 良

0 引 言

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是由中枢或外周神经系统的损伤或病变引起的一种慢性疼痛［1-2］，该病严重影响患者的日常生活、睡眠及社会活动，也是限制癌症化疗剂量与进程的关键因素［3］，由于病程长、治疗难等给患者带来了很大的经济负担和生活压力［4］。目前由于NP的发病机制的不明确性与复杂性，对于NP缺乏积极有效的治疗［5］，所以探讨维持疼痛状态的分子和细胞机制及积极有效的治疗方法具有重要意义。研究发现神经元活动诱导的Wnt信号刺激疼痛神经回路中脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表达［6］；WNT/β-catenin 信号通路参与了疼痛反应过程［7］。同时神经病理性疼痛的发生与神经炎症的发生发展有很大的关系［8-9］，因此阻断维持疼痛状态的WNT/β-catenin信号通路及抗炎治疗是缓解NP的关键思路。目前NP主要用西药阿片类和右美托咪定等止痛抗炎类药物［10-12］，但是西药的不良反应大且价格昂贵，给患者带来很大的身体与经济负担，不适合长期使用。传统中药具有药食同源的优势且不良反应小，雷公藤甲素（triptolide）是由传统中草药卫矛科植物雷公藤的根、叶、花及果实中提取，具有抗炎和免疫抑制作用［13-14］，治疗NP的报道不多且机制尚不明确；脉冲射频广泛应用于治疗各种条件下神经疼痛［15-16］，但是脉冲射频治疗具有效率低、镇痛时间短等缺点［17］，将脉冲射频与药物抗炎镇痛联合使用是否可延长镇痛时间，提高镇痛效率，降低药物使用剂量和由此带来的副作用，是治疗神经病理性疼痛的一个新突破点。因此，本研究将雷公藤甲素与脉冲射频联合应用于治疗SNL大鼠，探索治疗效果，并通过检测Wnt/βcatenin信号通路和相关炎性因子的变化，从而阐明雷公藤甲素、脉冲射频治疗法单独治疗及两者联合治疗3种方法的治疗效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器雷公藤甲素（38748-32-2，Med-ChemExpress）；RIPA裂解液（P0013B，Beyotime，中国江苏）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0010，Beyotime）、增强型化学发光试剂（P0018，Beyotime）、PVDF膜（HVHP29325，Merck Millipore）、SDS-PAGE凝胶试剂盒（P0012A，Beyotime）；兔抗 GAP-43多克隆抗体（ab12274，Abcam）；兔抗iNOS多克隆抗体（ab15323，Abcam）；兔抗COX-2多克隆抗体（ab15191，Abcam）；Trizol（9109，Takara）；PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（RR047A，Takara）；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（RR820L，Takara）。

1.2实验动物与分组健康8周龄SD雄性大鼠，135只，体重180～200 g，实验动物许可证号：SCK（甘）2015-0001，采用随机数字表法将大鼠分为5组：假手术组、模型组、雷公藤甲素组、脉冲射频组、联合治疗组，每组27只。

1.3方法

1.3.1大鼠脊神经结扎（spinal nerve ligation,SNL）模型建立将假手术组、模型组、雷公藤甲素组、脉冲射频组、联合治疗组的大鼠麻醉后沿L4-S1棘突做后正中偏右切口，暴露横突的根部，用弯成直角的针头向头端插入孔内。当针头触及DRG或神经根可引起同侧后肢肌肉轻微抽动，退出针头。结扎神经，缝合，腹腔连续3 d注射青霉素。假手术组除不进行背根神经结结扎外，其余操作同其他组。

1.3.2干预治疗雷公藤甲素组术后第1天开始（SNL当天视第0天）进行药物［雷公藤甲素，100 μg/（kg.d）］和脉冲射频组给予脉冲射频治疗［在背根神经结扎近端（距线结5 mm处］脉宽20 ms、频率500 kHz，脉冲频率2 Hz，温度42℃，持续时间8 min。假手术组与模型组给予等量等渗盐水灌胃。

1.3.3机械痛阈测量所有大鼠在造模前1d及术后第1、3、5、7、14天给药或/和脉冲射频干预治疗2 h后，对各组大鼠进行机械缩足反应阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）。每只大鼠每次检测3次，记下数值后求其均值，每次间断开5 min。

1.3.4样品采集各组大鼠SNL术后3、7、14 d行为能力测试结束后，各组取6只大鼠麻醉后处死，快速而准确的切取各组大鼠脊髓背根神经节（dorsal root ganglio，DRG）的L4-6节段，立即置于液氮中冻存用于Western blot及PCR检测。另取3只大鼠麻醉后，开胸经左心室插管进入主动脉根部，剪开右心耳，灌注PBS冲尽血液，然后采用4℃，4%多聚甲醛300 mL灌注固定1 h。取L4-6节段背根神经节，用于免疫组化检测。

1.3.5RT-PCR检测取收集到的DRG，采用Trizol法提取DRG中总RNA。并将RNA浓度统一稀释至500 ng/mL，用逆转录试剂盒进行反转录，获得的cDNA作为模板，扩增Wnt-3α、β-catenin及内参GAPDH基因。扩增引物序列如下：GAPDH 5'-3'AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT，5'-3'CCCCACTTGATTTTGGAGGGA；Wnt-3α 5'-3'GTCTCGTGGCTGGGTGGA，5'-3'GGGCTCGCAGAAGTTAGGTC；βcatenin 5'-3'GGTGAAAATGCTTGGGTCG，5'-3'TGAAGGCAGTCTGTCGTAATAGC。循环条件：94℃ 4 min，94℃ 20 s，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35个循环。其中在72℃30 s阶段中获取数据进行熔解曲线分析反应结束后，由仪器自带软件计算出Ct值并给出定量结果。计算基因的相对表达量F=2-△△Ct，公式如下：

1.3.6Western blot检测取收集到的DRG，向DRG中加入200 μL蛋白裂解液（含1 mmol/L PMSF），置冰上20 min后4℃、离心半径6.2 cm，12 000 r/min离心15 min，取上清液。用BCA测定蛋白浓度后调节至统一浓度。取20 μg蛋白样品（12%SDS-PAGE，5% 脱脂奶粉；90 V，转膜 60 min）室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜兔抗iNOS和COX-2多克隆抗体，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗室温孵育1 h（二抗：山羊抗兔1∶8000），TBST洗膜3次，10 min/次，用Western blot印迹法观察并进行半定量分析。条带采用Image J软件进行灰度值分析。

1.3.7免疫组化检测取收集到的DRG，将DRG放入4℃4%多聚甲醛中固定6 h，再放入30%蔗糖4℃过夜，然后将组织包埋成石蜡块，切片、爬片、脱腊后按照免疫组化试剂盒进行免疫组化。在倒置显微镜下观察GAP-43蛋白表达情况。

1.4统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差（xˉ± s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验分析，方差不齐时用Dunnett's方法分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1机械痛阈测定行为测试结果显示，假手术组MWT随时间无明显变化，其他各组MWT在术后持续下降，后出现回升；联合治疗组下降幅度最小，而上升幅度最大。与假手术组相比，其他各组MWT在术后各时间点均降低（P＜0.05）。雷公藤甲素组、脉冲射频组、联合治疗组术后MWT均高于模型组（P＜0.05），联合治疗组术后MWT显著高于雷公藤甲素组和脉冲射频组（P＜0.05）。见图1。

2.2 RT-PCR检测与假手术组造模后3、7、14 d相比，模型组、雷公藤甲素组、脉冲射频组、联合治疗组Wnt-3α、β-catenin mRNA表达量均显著升高（P＜0.05）；与模型组造模后3、7、14 d相比，雷公藤甲素组、脉冲射频组、联合治疗组Wnt-3α、β-catenin mRNA表达量降低（P＜0.05），见表1。

图1 机械痛阈值评估大鼠行为Figure 1 Mechanical withdrawal threshold（MWT）test to evaluation animal behavioral

2.3Western blot检测与模型组相比，在造模第14天后，雷公藤甲素组、脉冲射频组、联合治疗组iNOS和COX-2蛋白的表达随着治疗时间的增长而显著降低（P＜0.05），其中在同一时间下联合组比雷公藤甲素组和脉冲射频组下降幅度大。与假手术组相比，模型组iNOS和COX-2蛋白的表达均显著升高，并具有时间依赖性，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、图3。

2.4免疫组化检测GAP-43阳性表达为棕黄色颗粒，术后3d雷公藤甲素组、脉冲射频组及联合治疗组，GAP-43阳性表达染色较深较多，模型组GAP-43阳性表达较弱。与假手术组相比，模型组GAP-43蛋白相对表达量明显升高，并随时间的增长逐渐升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，各治疗组GAP-43蛋白相对表达量随着治疗时间的增长而显著升高，其中在同一时间下（在造模第14 d）联合治疗组比雷公藤甲素组和射频治疗组升高幅度大。见图4、图5。

图2 脊髓背根神经节中iNOS蛋白的相对表达量Figure 2 The relative expression of iNOS in dorsal root ganglion

1：假手术组；2：模型组；3：雷公藤甲素组；4：脉冲射频组；5：联合治疗组与假手术组相比，#P＜0.05；与模型组相比，*P＜0.05、**P＜0.01

表1 脊髓背根神经节中Wnt-3α、β-catenin mRNA的相对表达量（xˉ± s，n=27）Table1 The relative expression of Wnt-3α,β-catenin mRNA in dorsal root ganglion（xˉ± s，n=27）

图4 镜下观察脊髓背根神经节中GAP-43蛋白的表达（免疫组化染色×400）Figure 4 The relative expression of GAP-43 in dorsal root ganglion（IHC ×400）

图5 脊髓背根神经节中GAP-43蛋白表达的比较（×400）Figure 5 The relative expression of GAP-43 in dorsal root ganglion（×400）

3 讨 论

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是化疗最常见的副作用，这种副作用是一种可导致化疗停止的严重病理事件［18］，该病因其病因复杂疼痛程度严重，给患者带来极大的痛苦与生存压力［19-21］，目前全世界约有1.0～5.6亿人受到NP的困扰［19］，影响社会的稳定，因此研究NP的机制与治疗方案具有重要的意义。让NP患者避免长期服用镇痛药产生的不良反应和改善生活质量，联合用药是近年来比较有效的治疗NP的途径［22］，本研究在前人的研究基础上构建SNL大鼠NP模型，观察雷公藤甲素联合脉冲射频法治疗对Wnt/β-catenin信号通路及其炎性因子的影响。

研究发现MWT能准确地反映机械痛敏感性的变化，Liu等［23］通过建立SD大鼠神经性疼痛模型，发现 miR-155靶基因表达影响 MWT，Antal等［24］将部分坐骨神经结扎小鼠全身暴露于非均匀静磁场下，发现可以抑制在神经性疼痛保持对机械性刺激的较高敏感性。本研究通过脊神经结扎使大鼠MWT值显著降低，并随时间的增加MWT值持续维持在较低的水平，采用雷公藤甲素、脉冲射频法以及雷公藤甲素联合脉冲射频法干预一段时间后，均可阻止并逆转SNL大鼠MWT值的持续较低水平，但联合治疗组效果明显高于其他组，提示雷公藤甲素与脉冲射频法联合治疗对大鼠NP的缓解作用优于雷公藤甲素和脉冲射频法单独治疗。雷公藤甲素是一个具有多种生物活性的天然产物，具有抗氧化、抗类风湿、抗老年性痴呆症、抗癌及消炎止痛等功效，而神经炎症是导致神经病理性疼痛形成的关键因素［25］。

进一步的本研究发现各治疗组的iNOS和COX-2蛋白均随着治疗时间的增长而逐渐降低，其中雷公藤甲素联合脉冲射频治疗组的下降幅度最大，提示联合治疗组对大鼠脊神经结扎后神经疼痛与炎症具有很好的治疗效果；而GAP-43蛋白随着治疗时间的增长而逐渐升高，其中雷公藤甲素联合脉冲射频治疗组的上升幅度最大，提示联合治疗组能更好的促进神经元发育和再生。这种下降与升高均表现出时间依赖性，提示雷公藤甲素联合脉冲射频疗法对炎性因子的治疗效果显著，同时能显著的促进神经细胞再生，但作用机制尚不明确。

随着研究日渐深入，证实Wnt/β-catenin信号通路在神经病理性疼痛炎症的形成和维持中具有重要作用［26］，本研究发现与模型组相比，各治疗组Wnt-3α和β-catenin mRNA表达量均随时间增长而显著下降，其中在同一时间下联合治疗组下降幅度最大，提示雷公藤甲素与脉冲射频法联合治疗对大鼠神经病理性疼痛的治疗效果优于雷公藤甲素和脉冲射频法单独治疗。Wnt/β-catenin信号转导通路是一条在生物进化中极为保守的通路，但是当细胞外Wnt信号被激活后，Wnt信号分子与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合，使β-catenin在胞质中积累起来。β-catenin的积累抑制下游蛋白质复合物（β-catenin降解复合物）的表达，而这些蛋白复合物可促进细胞内信号分子β-catenin的降解。此外，当“β-catenin降解复合物”被抑制后，Wnt/β-catenin信号通路转为活化状态。以上提示，雷公藤甲素联合脉冲射频法可能通过调节frizzled相关蛋白的功能，使其与Wnt竞争性地同Wnt受体Frizzled结合，从而拮抗Wnt信号，当Wnt信号失活后β-catenin被磷酸化，导致β-catennin降解，达到治疗SNL大鼠神经痛的作用。

综上所述，雷公藤甲素与脉冲射频法联合治疗大鼠NP的治疗效果优于雷公藤甲素和脉冲射频法单独治疗，即联合治疗对SNL大鼠Wnt/β-catenin信号通路及炎性因子的影响效果优于单独治疗，提示联合治疗对神经炎症具有更强的缓解作用及促进神经细胞的再生，为临床治疗NP提供新的思路。