蒙花苷通过调控IKK/NF-κB信号通路抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭*

黄器伟， 黄 涛△， 牛美兰， 张艳慧， 李道明

(1黄河科技学院， 河南 郑州 450099； 2郑州大学第一附属医院， 河南 郑州 450052)

乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一。在欧盟和美国，每年死于乳腺癌者分别达到92 600例和40 610例，其死亡率位居女性恶性肿瘤谱前2位[1-2]。在我国，每年新增女性乳腺癌患者约268.6万例，发病率位居女性恶性肿瘤谱第1位[3]。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)约占乳腺癌总发生率的15%～20%，因其侵袭性强和远处转移率高，导致TNBC患者复发率高，生存率低[4]。因此，如何抑制侵袭和转移成为目前TNBC临床治疗中亟待解决的问题之一。蒙花苷(linarin，LIN)是从菊花科植物野菊花中提取的一种黄酮类化合物。有研究表明，LIN可抑制前列腺癌、肺癌和神经胶质瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡，且对正常细胞无显著毒性作用[5-7]。Jung等[8]研究证实，LIN可通过下调基质金属白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)蛋白表达抑制电离辐射诱导的人肺癌A549细胞迁移和侵袭。但目前关于LIN对人TNBC细胞侵袭能力的作用尚未见报道。本研究拟通过分子生物学方法探究LIN对人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞及人乳腺上皮MCF-10A细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和RPMI-1640培养液购自HyClone；LIN购自中国食品药品检定研究院；IκB激酶α/β(IκB kinase α/β, IKKα/β)抑制剂IKK-16和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)抑制剂PDTC购自Sel-lect；CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物公司；Anne-xin V-FITC凋亡检测试剂盒、结晶紫染色液、RIPA裂解液和ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Matrigel和Transwell小室购自Corning；兔抗人Snail、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、MMP-9、NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of nuclear factor-κB α，IκBα)、p-IKKα/β(Ser176/177)、p-p65(Ser536)和β-actin单克隆抗体购自Abcam。

2 方法

2.1细胞培养 用含10% FBS的RPMI-1640培养液，在37 ℃、5% CO2条件下培养MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞和MCF-10A细胞；每2～3 d按1∶3的比例传代1次。

2.2CCK-8法检测细胞活性 取对生长期细胞，将细胞以每孔5 000个接种于96孔板，常规培养24 h；去上清，弃原培养液，加入100 μL含不同浓度(0、 5、 10、 20、 40、 80和160 μmol/L)LIN的细胞培养液，每个浓度设5个复孔；继续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h，用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度(A)值；计算细胞活力。细胞活力(%)=(药物组A值-调零组A值)/(对照组A值-调零组A值)×100%。采用SPSS 17.0软件的Probit回归模型计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.3集落形成实验 将MDA-MB-231细胞以每孔200个细胞接种于6孔板，分别用0，5和10 μmol/L LIN处理24 h；常规培养2 周后，PBS洗涤2次，甲醇固定10 min，PBS洗涤2次，结晶紫染色30 min，PBS洗涤2次；在光学显微镜下计数大于50个细胞的集落数，计算集落形成率。集落形成率(%)=集落数/接种细胞数×100%。

2.4Transwell法检测细胞迁移能力 细胞分组同2.3，收集各组细胞，制成密度为2×108/L的细胞悬液；将Transwell小室置于24孔板中，向小室下方的24孔板中加入600 μL细胞培养液，向小室内加入200 μL细胞悬液，常规培养12 h；取出小室，用棉签擦去小室内的细胞，PBS洗涤2次，甲醛固定30 min，结晶紫染色20 min；PBS 洗涤2次，显微镜下观察小室下表面附着的迁移细胞，随机挑选5个视野拍照计数；计算迁移率(migration rate)。迁移率(%)= (药物组迁移细胞数/对照组迁移细胞数)×100%。

2.5Transwell法检测细胞侵袭能力 将Matrigel基质胶与RPMI-1640培养基按1∶6比例混合均匀后，取50 μL加入到Transwell小室底部，然后将Transwell小室放入24孔板中，37 ℃孵育过夜；后续操作与2.4相同，此时小室下表面附着的为侵袭细胞；计算侵袭率(invasion rate)。侵袭率(%)=药物组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数×100%。

2.6Western blot法检测蛋白水平 收集各组细胞，用RIPA裂解各组细胞提取总蛋白，用紫外分光光度法测定样品中蛋白质浓度；样品蛋白经SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h；加入 I 抗(均为1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，加入 II 抗(1∶2 000稀释)室温下孵育1 h；TBST洗膜3次，加入ECL进行发光反应，暗室X胶片显影，拍照；使用ImageJ 1.45s软件进行灰度分析，以目标蛋白与内参β-actin灰度值的灰度比值作为目标蛋白的相对表达水平。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0分析数据。实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni法进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 LIN对MDA-MB-231细胞增殖的影响

CCK-8法检测结果显示，与对照组相比，不同剂量LIN处理24 h后， MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞活力均显著降低(P<0.05)，且随LIN剂量的增加呈下降趋势，IC50分别为104.33 μmol/L 和55.89 μmol/L；但经不同剂量LIN处理24 h后，MCF-10A细胞活力与对照组的差异无统计学显著性(P>0.05)，见图1。

Figure 1.The effect of LIN on the viability of MCF-10A cells, MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control (0 μmol/L) group.

集落形成实验结果显示，20 μmol/L LIN处理24 h后，MDA-MB-231细胞的集落形成率显著低于对照组(P<0.05)，而经5和10 μmol/L LIN处理24 h后， MDA-MB-231细胞的集落形成率与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

Figure 2.The effect of LIN on the colony formation of MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control (0 μmol/L) group.

2 LIN对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示，与对照组相比，经5和10 μmol/L LIN处理24 h后，MDA-MB-231细胞的迁移率和侵袭率均显著降低(P<0.05)，且迁移率和侵袭率随药物剂量的增加而下降(P<0.05)，见图3、4。

Figure 3.The effect of LIN on migration ability of MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control (0 μmol/L) group; #P<0.05 vs 5 μmol/L group.

Figure 4.The effect of LIN on the invasion ability of MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control (0 μmol/L) group; #P<0.05 vs 5 μmol/L group.

3 LIN对Snail、E-cadherin和MMP-9蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与对照组相比，5和10 μmol/L LIN组的Snail和MMP-9蛋白水平显著降低(P<0.05)，E-cadherin的蛋白水平显著升高(P<0.05)；且各药物组间Snail、E-cadherin和MMP-9蛋白水平的差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

Figure 5.The effect of LIN on the protein levels of Snail, E-cadherin and MMP-9 in MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 μmol/L group; #P<0.05 vs 5 μmol/L group.

4 LIN对p-IKKα/β、p-p65和IκBα蛋白水平的影响

Western blot结果显示，与对照组相比，5和10 μmol/L LIN组的p-IKKα/β和p-p65蛋白水平显著降低(P<0.05)，IκBα的蛋白水平显著升高(P<0.05)；且各药物组间p-IKKα/β、p-p65和IκBα蛋白水平的差异有统计学意义(P<0.05),见图6。

Figure 6.The effect of LIN on the protein levels of p-IKKα/β, p-p65 and IκBα in the MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 μmol/L group; #P<0.05 vs 5 μmol/L group.

5 LIN与IKK-16或PDTC联用对Snail、E-cadherin和MMP-9蛋白表达的影响

分别给予5 μmol/L IKK-16(IKK-16组)、10 μmol/L PDTC(PDTC组)及10 μmol/L LIN+5 μmol/L IKK-16(IKK-16+LIN组)或10 μmol/L PDTC(PDTC+LIN组)作用24 h，Western blot结果显示，与对照组相比，IKK-16组、PDTC组、IKK-16+LIN组和PDTC+LIN组的Snail和MMP-9蛋白水平均显著降低(P<0.05)，而E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05)；同时，IKK-16+LIN组和PDTC+LIN组的Snail和MMP-9蛋白水平分别低于IKK-16组和PDTC组(P<0.05)，IKK-16+LIN组和PDTC+LIN组的E-cadherin蛋白水平则分别低于IKK-16组和PDTC组(P<0.05)，见图7。

Figure 7.The effect of LIN combined with IKK-16 or PDTC on the protein levels of Snail, E-cadherin and MMP-9 in the MDA-MB-231 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs IKK-16 group; △P<0.05 vs PDTC group.

讨 论

蒙花苷具有抗炎、镇痛、退热、保肝、抗病毒和抗骨质疏松等药理作用[9-13]。近年来，LIN的抗肿瘤作用逐渐受到人们的关注。Zhen等[7]研究表明，LIN可抑制神经胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡，这可能与其抑制NF-κB信号通路以及上调p53蛋白有关。Xu等[14]研究证实，LIN可通过激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)增强肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)诱导的神经胶质瘤细胞凋亡。本研究显示，LIN可显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，且呈剂量依赖性；同时还发现，低浓度LIN可剂量依赖性地抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭。

E-cadherin是介导细胞间黏附的一种钙依赖性跨膜糖蛋白，其胞内区通过连环蛋白锚定于细胞骨架上，可使相邻细胞形成稳定的连接。E-cadherin表达下调或缺失会往往会导致肿瘤细胞的运动能力增强，因此成为肿瘤细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的主要标志之一[15]。Snail是一种具有锌指结构的转录因子，可直接结合E-cadherin基因启动子的E-box作用元件，并抑制其表达[16]。Mali等[17]研究证实，上调E-cadherin蛋白水平和下调Snail蛋白水平可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞。本研究显示，LIN可剂量依赖性地下调MDA-MB-231细胞中Snail的蛋白水平，上调E-cadherin的蛋白水平。

细胞外基质和基底膜是阻止恶性肿瘤细胞侵袭的天然屏障。恶性肿瘤细胞可分泌多种基质金属蛋白酶破坏细胞外基质和基底膜的完整性，侵犯周围组织，并进入血液循环和淋巴系统向远处转移。MMP-9属基质金属蛋白酶超家族成员中明胶酶的一种，可高效降解Ⅳ型胶原蛋白，而Ⅳ型胶原蛋白是构成细胞外基质和基底膜的主要成分。Mori等[18]研究证实，下调MMP-9蛋白表达可抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力。本研究表明，LIN可下调MDA-MB-231细胞中MMP-9蛋白水平，且呈剂量依赖性。

多项研究表明，NF-κB信号通路在乳腺癌细胞侵袭和转移过程中发挥着重要作用[19-20]。哺乳动物细胞中最常见的NF-κB是由p65(RelA)和p50构成的异型二聚体。NF-κB通常与IκBα结合，以非活性状态存在于胞浆中。激活的IKK可磷酸化IκBα使其被泛素化途径降解，同时也磷酸化p65，从而激活NF-κB信号通路[21]。在MDA-MB-231细胞中抑制NF-κB活化可下调Snail和MMP-9蛋白表达，并上调E-cadherin蛋白表达导致MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力下降[20-21]。

在本研究中，LIN可抑制MDA-MB-231细胞中IKKα/β和p65蛋白磷酸化，并上调IκBα蛋白水平。IKK抑制剂IKK-16和NF-κB抑制剂PDTC可分别抑制IKKα/β和p65蛋白磷酸化，导致IKK/NF-κB信号通路失活[22-23]。本研究证实，IKK-16和PDTC均可下调MDA-MB-231细胞中Snail和MMP-9蛋白水平，并上调E-cadherin蛋白水平。这表明，IKK/NF-κB信号通路可能介导了LIN对Snail、E-cadherin和MMP-9蛋白表达的调控。

综上所述，LIN可在体外抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力，这可能与其抑制IKK/NF-κB信号通路活化，进而下调Snail和MMP-9蛋白水平，上调E-cadherin蛋白水平有关。本研究为进一步丰富LIN的抗肿瘤侵袭作用提供了新的实验依据。