抗氧化剂对寒富苹果酒发酵过程成分及抗氧化性的影响

张雨茜，颜廷才，张 娟，史 琳，孟宪军

（沈阳农业大学 食品学院，沈阳 110161）

寒富苹果是由沈阳农业大学选择培育出的抗寒性极强的优质苹果品种[1]，其果实具有个大整齐、酥脆多汁的特点，同时相较于富士等品种，表现出了极好的耐贮藏性[2-4]。近年来，寒富苹果在全国各地得到了广泛的种植，寒富苹果的种植面积不断扩大、产量不断增加，价格却一路走低。为解决这一生产矛盾，保护广大农户的利益，开展寒富苹果深加工研究十分必要[5]。苹果酒是苹果原汁经过发酵得到的一种低酒精度的果酒[6]，苹果酒保留了苹果原有的糖类、氨基酸、矿物质以及苹果特有的有机酸等物质，同时富含具有抗氧化活性的酚类物质，营养丰富，具有保健功效[7-9]。目前，国内外的消费者越来越青睐于苹果酒等低酒精度果酒[10]，这就使生产寒富苹果酒成为寒富苹果加工利用的新方向。

苹果酒生产中的氧化褐变问题是影响其品质的重要因素，在果酒生产中常通过添加抗氧化剂的方法阻止酒体的劣变[11]。目前，国内外常用的抗氧化剂有很多，本试验选用的5种抗氧化剂在果蔬保鲜加工领域应用广泛。维生素C，又称抗坏血酸，作为一种多糖化合物，它本身就具有很强的抗氧化能力，还作为鲜水果品质的重要衡量指标，同时在鲜切水果保鲜[12-13]、果酒防褐变方面[14-15]均有突出贡献；赖氨酸可有效延长鲜切果蔬货架期，有效控制鲜切菠菜细菌含量，有很好的护色抗氧化作用[16-17]，其参与美拉德反应后的产物有很大抗氧化活性[18]；葡萄糖氧化酶具有酶的专一性，同时有天然无污染的特点，被广泛应用于果汁[19]、果酒[20]酿造中，起到防止褐变，延长保质期的作用；而氯化钠和柠檬酸也在保鲜和果酒抗氧化方面有很多应用，苹果酒中加柠檬酸可有效控制美拉德反应，防止褐变发生[21-22]；氯化盐有较好的果蔬护色效果，其能力堪比稍贵的抗坏血酸盐，可成为其低价替代品[23]，但根据学者们的相关研究总结，1%～1.5%(w/v)才能起到很好的抗氧化及护色作用。本试验将寒富苹果作为原材料，通过研究不同抗氧化剂对苹果果酒酿造过程中营养成分及酚类物质与其抗氧化活性的影响，选择合适的抗氧化剂用于寒富苹果酒的生产，进而达到推动寒富苹果酒发酵向有利方向发展的目的，为市场提供营养丰富的苹果酒新品；同时，可解决寒富苹果的产量过剩的问题，提高寒富苹果种植经济效益，促进寒富苹果产业健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：寒富苹果，2016年10月9日购于沈阳市东陵区深井子金德胜果园，表面全部转红，完全成熟，大小不分级，运回实验室5℃冷库中存贮。

主要试剂：白砂糖（广州福正东海食品有限公司）；活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）；福林酚试剂、一水合没食子酸[鼎瑞化工（上海）有限公司]；无水乙醇、焦亚硫酸钠、赖氨酸、维生素C、柠檬酸、氯化钠、葡糖氧化酶、碳酸钠(沈阳沈一精细化学品有限公司)；总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒、二苯基三硝基苯肼（DPPH）、总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）(上海鼎国生物技术有限公司)。

主要仪器：MJBL25B26榨汁机(广州美的集团股份有限公司)；AE523电子天平(上海恒平科学仪器有限公司)；pH7110/7310实验室台式pH/mV测试仪(上海邦沃仪器设备有限公司)；JC510-AY32手持式糖度折光仪(北京百万电子科技有限公司)；Q-250ES超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV1902PC紫外可见分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)；KXW-80A旋涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)；全波长酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 寒富苹果酒试验处理 将寒富苹果从冷库中取出后置于22℃室温，清洗后，通心去核，切分后榨汁处理。为使榨出苹果汁初始成分相同，对苹果汁进行成分调整。试验中寒富苹果榨汁后的糖度为140g·L-1，通过添加白砂糖的方式调整苹果汁糖度至220g·L-1。混匀后，分装于发酵瓶中，每瓶2L。5瓶分别添加1g·L-1NaCl、1g·L-1柠檬酸（citric acid，CA）、200mg·L-1Vc、200mg·L-1Lys、200mg·L-1葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）作为 5 个处理组，原汁发酵作为对照组，再分别添加200mg·L-1安琪活性干酵母（需要提前0.5h用10倍温水活化，添加10%蔗糖，让酵母充分生长，有酸味与气泡产生），混匀后置于室温（22℃）、避光条件下进行静置发酵。每天观察发酵情况，每天至少摇晃2～3次，每5d测定1次指标，20d后过滤，倒罐进行后发酵。

各抗氧化剂使用量是通过大量文献阅读参考后确定的，其中氯化钠和柠檬酸使用量稍多，是由于氯化钠和柠檬酸使用量需达到1%～2%(w/v)才能起到较好的护色抗氧化作用，而考虑到氯化钠和柠檬酸自身味感对酒体口感的影响，选择添加浓度为1g·L-1，这样既能保证抗氧化效果同时又不影响苹果酒口感。

1.2.2 酒精计法测定酒精度 参照GB/T 15038-2006中果酒酒精度的测定方法[24]。

1.2.3 手持式糖度折光仪测定可溶性固形物的测定 取待测发酵液数滴，置于手持式糖度折光仪的检测棱镜上，将仪器进光板对准光源进行读数测定。测定时应注意用蒸馏水进行调零后再测量，测定过程中注意避免气泡的产生，同时注意测定时的温度校正。

1.2.4 福林酚法测定总酚含量 没食子酸标准曲线的绘制：首先配制1000mg·L-1没食子酸标准溶液，再用蒸馏水稀释配备质量浓度为0，10，20，30，40，50mg·L-1的没食子酸标准溶液。避光条件下用移液枪分别移取6种质量浓度不同的1mL没食子酸标准溶液于6个试管中，分别依次加入蒸馏水5mL、等体积稀释后的FC试剂1mL、7.5%的Na2CO33mL，用涡旋混合器进行均质。显色90min后，用紫外分光光度计于765nm波长下测定吸光值，重复3次。以吸光度值为纵坐标，一水合没食子酸含量为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线。

寒富苹果酒中总酚含量的测定：取寒富苹果酒发酵液50mL于烧杯中，加入150mL的无水乙醇，使用超声波进行辅助提取10min，之后静置30min，将所得溶液抽滤后在45℃下旋蒸至干燥后，乙醇溶解定容至50mL后抽滤，制成各处理多酚提取液。取寒富苹果多酚提取液1mL，按照没食子酸标准曲线的测定方法测得各寒富苹果酒发酵液样品的吸光值，代入回归方程后可计算出总酚的含量，每组样品重复3次。

1.2.5 DPPH法测定清除自由基能力 参考吕春茂等[25]的方法并略加修改。

寒富苹果酒发酵液作为待测样本，按照表1依次向A0，Ai，Aj试管中加入相应试剂再进行测定。其中DPPH溶液的制备，需要准确称取0.1984g DPPH，用无水乙醇溶解定容至250mL，再取10mL定容后的液体，用无水乙醇稀释至100mL作为DPPH待用液。充分混匀后室温静置30min，用紫外分光光度计于734nm波长下测量试管 A0、Ai、Aj对应吸光度（OD）值 D0、Di、Dj，注意测定前用蒸馏水调零，平行测定3次。计算公式为：

表1 DPPH法清除自由基能力测定方法Table 1 DPPH method for testing of free radical scavenging capacity /mL

1.2.6 T-AOC法测定总抗氧化能力 取寒富苹果发酵液作为待测样本，对照管添加样本为蒸馏水。根据试剂盒测定方法按照表2加入相应溶剂，配制成应用液。混合试剂是由试剂一、试剂二、试剂三按照1∶2∶0.5的比例配制而成，其中试剂二为白色晶体，使用前需用120mL双蒸水溶解，混合试剂需要现用现配，注意添加完混合试剂后要用涡旋混合器充分混匀，并于37℃水浴30min。所有溶剂添加完后室温反应10min，用紫外分光光度计于520nm波长处分别测出对照管和测定管对应的吸光度（OD）值，注意测定前用双蒸水进行调零，平行测定3次。37℃条件，每分钟反应体系由于每毫升的样品加入，吸光度值增加0.01时，可作为一个总抗氧化能力的单位。计算公式为：

1.2.7 ABTS法测定总抗氧化能力 取寒富苹果发酵液作为待测样本，根据试剂盒方法按照表3依次向对应孔位加入试剂，进行测定。ABTS工作液是由ABTS工作母液（ABTS溶液∶氧化剂溶液=1∶1混合均匀后室温下避光放置14h）用80%乙醇稀释45倍得到的，注意现用现配。所有试剂添加完成后于室温条件下孵育3min，用酶标仪于734nm处测定各孔对应吸光度（OD）值，平行测定3次。以总抗氧化能力（不同Trolox标准品浓度）为横坐标，标准孔对应OD值为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。将待测样本对应测定孔OD值代入方程，得到寒富苹果发酵液的总抗氧化能力。

表2 T-AOC法总抗氧化能力测定方法Table 2 T-AOC method for testing of total antioxidant capacity /mL

表3 ABTS法总抗氧化能力测定方法Table 3 ABTS method for testing of total antioxidant capacity /μL

2 结果与分析

2.1 抗氧化剂对寒富苹果酒发酵过程可溶性固形物变化的影响

由图1可知，添加NaCl、Lys、Vc、CA、GOD这5种抗氧化剂处理与不添加任何抗氧化剂的原汁发酵CK组相比，可溶性固形物变化规律基本相似。可溶性固形物含量总体呈下降趋势，从初始的22%，发酵15d内快速降至2.2%，之后变化缓慢，发酵20d基本在2.0%。这是因为苹果酒的发酵过程中对糖类物质的消耗主要是微生物促使葡萄糖等有机物向酒精转变，与此同时，氨基酸和蛋白质等含氨基的物质也会与糖类物质反应，使可溶性固形物减少。由图1还可知，加入抗氧化剂发酵的前5d，添加Vc与Lys两组的可溶性固形物含量下降缓慢，添加Vc后的5d，可溶性固形物含量只减少3.8%，添加Lys后可溶性固形物含量降低5.4%，而其他组与对照组无明显差异，可溶性固形物含量降低7%。可见，这5种抗氧化剂除Vc前期可明显减缓可溶性固形物消耗速度外，其他处理对可溶性固形物的发酵影响不大。

2.2 抗氧化剂对寒富苹果酒发酵过程酒精度变化的影响

酒精是果酒的主要成分，也是果酒区别于果汁的重要成分之一，同时酒精的生成速度是检验果酒发酵过程是否顺利的重要指标。由图2可知，添加5种抗氧化剂处理组与对照组相比，酒精生成规律基本相似，同时生成趋势也与可溶性固形物的消耗趋势表现出了契合性，酒精度在前10d快速升高至7.0%vol，10～15d生成速度减缓，15d达到8.0%vol以后酒精度基本不再变化，标志着发酵过程的基本结束。相比之下，发现发酵的前5d，Vc、CA及GOD处理组与CK相比，酒精浓度升高缓慢，Vc处理组在发酵的前5d酒精生成量只有2.3%vol，CA、GOD组酒精生成量在2.5%vol，而对照组自然发酵条件下酒精生成量在4.2%vol。经过20d的发酵，NaCl、Lys处理组合CK组的酒精度达到8.5%vol，而经过CA和GOD处理后，酒精度只有8.0%vol，但可以发现发酵结束时，添加抗氧化剂组与对照组最后的酒精度均稳定在8.3%vol，可见，添加Vc、Lys及GOD这3种抗氧化剂可以在发酵前期减缓酒精生成速度，但并不影响寒富苹果酒正常的发酵进程。

2.3 抗氧化剂对苹果酒发酵过程中色泽的影响

图1 抗氧化剂对发酵过程可溶性固形物的影响Figure 1 Effect of antioxidants on total soluble solid during fermenting process

图2 抗氧化剂对发酵过程乙醇生成的影响Figure 2 Effect of antioxidants on alcohol generating during fermenting process

由图3可知，寒富苹果酒发酵过程中其颜色逐渐变浅，发酵液逐渐变得清澈透明。添加抗氧化剂当天，Vc组的护色效果明显优于其他处理组和对照组，苹果汁呈现黄色，其他抗氧化剂处理组都呈现黄褐到褐色。在发酵的0～5d，发酵液开始有气泡产生，同时酒体中存在大量絮状物。到了发酵的5～10d，苹果汁颜色逐渐变浅，絮状物逐渐减少，但由于酒体的浑浊，各个抗氧化剂处理之间颜色差异不明显。发酵15d后，发酵过程变得非常缓慢，气泡明显减少，果渣基本沉淀到底部，颜色明显变浅。发酵20d后，发酵基本停止，离心过滤处理后酒体澄清，颜色以浅黄到浅黄褐色。此时各处理组与对照组颜色差异不明显，可以看到CA处理组护色效果稍好一点，同时发现在发酵初期表现出良好护色效果的Vc处理组，在后续发酵过程中护色效果逐渐减弱。

图3 抗氧化剂对发酵液色泽的影响Figure 3 Effect of antioxidants on color during fermenting process

2.4 抗氧化剂对寒富苹果酒发酵过程中总酚含量的影响

由图4可知，曲线的回归方程为y=0.005x+0.0814，R2=0.9997，说明在总酚含量在 0～35mg·L-1之间，吸光度值与浓度呈现良好的线性关系。根据没食子酸标准曲线，可计算出样品中总酚的含量。

由图5可知，寒富苹果酒发酵过程中Vc、Lys及GOD处理组和对照组总酚含量变化规律一致，呈现出先升高后下降的趋势。Vc处理组总酚含量明显高于其他组，在发酵初期达到560mg·L-1，总酚含量比CK组高263mg·L-1，发酵5d后上升到707mg·L-1，发酵20d后含量降低到231mg·L-1，但总酚含量仍比其他处理组高112～55mg·L-1；Lys与CA处理组在发酵初期总酚初始含量是320mg·L-1，与其他几组表现不同的是，在后续发酵过程中总酚含量持续下降，未出现升高的现象，到20d后总酚含量降低到120mg·L-1；所有组在寒富苹果酒发酵的5～20d总酚含量的持续下降，同时在发酵的5～10d之间下降速度较快。总体看来，Vc处理组总酚含量远高于其他处理组，Vc是5种抗氧化剂中对总酚保护作用表现最突出的。

2.5 抗氧化剂对寒富苹果发酵液清除DPPH自由基能力的影响

寒富苹果酒发酵过程中，发酵液的DPPH自由基清除能力总体呈现下降趋势，不同处理组的清除DPPH自由基能力变化规律不明显，清除率在94.62%到80.42%之间波动，其效果如图6。由图6可知，NaCl与CA抗氧化剂处理能够提高初始的DPPH自由基清除能力，清除率初始值最高的是CA处理，为94.62%；其次是NaCl的92.08%，其他处理与对照接近89%。发酵10d时，NaCl处理与CA处理清除率急剧下降；NaCl处理清除率降低到最小值80.42%，CA处理清除率降低到最低值83.52%，之后这两个处理的DPPH自由基清除能力又有所升高；其他处理清除率一般90%，保持平稳下降趋势。Vc处理组在整个过程中都表现出极好的清除能力，且发酵20d时，Vc处理清除率最高，为88.07%，清除率最低的是Lys处理，为82.07%。发酵结束后，只有Vc处理清除率基本不变，其他处理都有所降低。同时值得注意的是，虽然NaCl处理组清除DPPH自由基的能力波动性很大，但在20d发酵结束时，清除效果仅次于Vc。寒富苹果酒发酵液的DPPH自由基清除能力结果与总酚含量总体变化上具有一致性，但是没出现第5d时，清除率随含量急剧升高的现象，这个过程的具体原因还需要进一步探索。

图4 一水合没食子酸标准曲线图Figure 4 Standard curve of gallic acid

图5 抗氧化剂对发酵过程中总酚含量的影响Figure 5 Effect of antioxidants on total polyphenol during fermenting process

2.6 抗氧化剂对寒富苹果发酵液T-AOC法总抗氧化能力的影响

寒富苹果酒发酵过程中，使用T-AOC法测定发酵液对Fe3+的还原能力作为发酵液的总抗氧化能力。测定结果中总抗氧化能力总体呈先升高后下降的趋势，与总酚含量变化趋势相同，最大值出现在发酵第5d时；发酵20d时，总抗氧化能力与初始值接近；各抗氧化剂的添加对寒富苹果酒还原Fe3+的能力影响较大。由图7可知，发酵初期，添加Vc的处理组还原Fe3+的能力最强，为23.67U·mL-1；对照处理最低，为6.97U·mL-1；其他处理组的总还原能力为11U·mL-1。发酵到第5d时，Vc处理的Fe3+还原能力达到50.63U·mL-1峰值；其次是CA处理，为38.43U·mL-1；最低的是Lys处理，为23.55U·mL-1。随着发酵进行，寒富苹果酒的总抗氧化能力逐渐下降，Vc与CA处理下降幅度较大，Lys处理下降幅度最小。发酵到20d时，还原Fe3+能力最低的CA处理，为9.13U·mL-1；其次是 Lys处理，为 9.62U·mL-1；最高的是 NaCl处理，为 19.31U·mL-1。整个发酵过程，NaCl、GOD 与对照处理总抗氧化能力比初期升高，涨幅最大的是NaCl处理，升高了44%；Vc、Lys与CA处理总体抗氧化性比初始值降低，降低最多的是Vc处理，由最初的23.67U·mL-1下降到12.45U·mL-1，下降47%。

图6 抗氧化剂对发酵过程中果酒清除DPPH自由基能力的影响Figure 6 Effect of antioxidants on scavenging ability of DPPH free radical during fermenting process

图7 抗氧化剂对发酵过程中T-AOC法总抗氧化能力的影响Figure 7 Effect of antioxidants on total antioxidant capacity of T-AOC during fermentation

2.7 抗氧化剂对寒富苹果发酵液清除ABTS+·的能力的影响

由图8可知，曲线的回归方程为y=0.2083x+0.08，R2=0.9998，说明总抗氧化能力（Trolox浓度）在0～1.5mM范围内与吸光度呈现了良好的线性关系。可根据Trolox标准曲线计算出寒富苹果酒待测样品的ABTS总抗氧化能力。

通过测定寒富苹果酒发酵过程中发酵液清除ABTS+·的能力来观察其总抗氧化能力的变化趋势。由图9可知，各个处理的发酵液清除ABTS+·的能力在发酵过程中，整体呈现下降趋势，下降幅度较小，变化趋势比较平缓。发酵初期各个处理之间清除ABTS+·能力差异比较显著，最高的是Vc处理，达到0.99mM，其次是NaCl处理，为0.87mM，最低的是对照处理，为0.44mM。Vc与NaCl处理组的清除ABTS+·能力始终处于较其他处理高的水平。对照处理在发酵5d，Vc，CA，GOD处理在发酵15d时，ABTS抗氧化能力有小幅升高过程，差异最大的Vc处理，升高0.1mM，其他两个处理升高幅度只有0.05mM。发酵20d时，Vc处理仍然是最高的，达到0.63mM，其次也还是NaCl处理，为0.56mM，最低的是Lys处理，清除ABTS+·能力只有0.3mM。对照、CA及GOD处理都在0.38mM。可见，抗氧化剂处理增强了寒富苹果酒中发酵液清除ABTS+·能力，尤其是Vc处理能明显提高发酵液的总抗氧化能力。

图8 Trolox标准曲线图Figure 8 Trolox standard curve

图9 抗氧化剂对发酵过程中ABTS总抗氧化能力的影响Figure 9 Effect of antioxidants on total antioxidant capacity of ABTS during fermentation

3 讨论与结论

寒富苹果酒的发酵过程中，可溶性固形物含量下降速度和酒精的生成速度，是反映其发酵进程的重要指标。结果表明，发酵的前5d，Vc处理和Lys处理不同程度上减缓了可溶性固形物的消耗速度，这是由于可溶性固形物主要是指可溶性糖类，也包括水溶性的维生素、矿物质等，Vc自身也可被检测出，因此出现Vc处理延缓发酵前期可溶性固形物下降速度现象；而Lys处理组产生这种现象的原因可能是Lys含有氨基，添加到酒体中，使酒体中氨基与羰基的比例增大，不利于羰氨反应的进行[26-27]，暂时性的减缓了对糖类物质的消耗。同时发酵的前5d，Vc、Lys及GOD处理组减缓了苹果酒的酒精生成速度，通过对可溶性固形物变化的分析，Lys和Vc减缓了可溶性固形物的消耗速度，自然乙醇的生成速度也会变慢；而GOD处理组可溶性固形物消耗速度没有出现减缓的现象，乙醇生成速度却出现了明显的减缓趋势，是由于GOD可将葡萄糖转化成葡萄糖酸，生成酵母无法利用的营养物质[28-29]，与此同时只有酵母消耗的葡萄糖转化成了乙醇，才产生了这种不一致现象。但经过20d的发酵后，添加抗氧化剂和对照组的可溶性固形物含量及酒精含量无明显差异，这表明添加抗氧化剂不会影响寒富苹果酒的正常发酵。

苹果酒的色泽是评价苹果酒品质的重要指标之一，由于在苹果破碎过程中会混入氧气，而苹果中又富含多酚物质，在多酚氧化酶（PPO）的作用下，生成邻醌等物质，再进一步与酚类物质或氨基酸、蛋白质等物质发生缩合反应生成褐色物质，严重影响苹果酒的品质[30-31]，因此要通过添加抗氧化剂的方式抑制酚类物质氧化褐变的发生，保证酒体的良好色泽。结果表明，Vc在发酵前期表现出极好的护色功能，这是由于Vc通过钝化金属离子的方式抑制PPO的活性，同时Vc优先自氧化优于酚类物质，抑制酶促褐变反应的发生[32-33]，保护酒体颜色，而到了发酵后期Vc处理组颜色逐渐加深，这可能是因为Vc稳定性较差，对温度比较敏感，在整个发酵过程中逐渐被氧化，抑制褐变能力没有初期明显。发酵的20d，CA处理组由于酸性物质的加入降低了酒体的pH，营造的酸性环境不利于PPO的活性，同时CA螯合PPO活性位点上的Cu2+，抑制PPO活性，从而起到护色、防止褐变的作用[34-35]，使酒颜色更清透。Vc处理对苹果酒发酵前期抑制褐变效果明显，后续能力减弱，CA抑制褐变的能力缓慢但可持续性进行，两者在护色方面表现都很突出。若对寒富苹果汁进行护色，建议采用Vc处理；对于寒富苹果酒护色，由于发酵过程本身是氧化又还原过程，会把多数酚类物质重新还原，变成无色酚类，可以不用添加抗氧化剂，若想保持较好地色泽，可以适当添加Vc或CA。

酚类物质对苹果酒的品质起着决定性的作用，是苹果酒的主要活性物质，其含量的变化影响苹果酒的色泽、口感与风味，同时由于其自身具有抗氧化的作用，增强了苹果酒的功能性[36-38]，因此在寒富苹果酒发酵过程中要尽可能保留有利酚类物质，提高寒富苹果酒品质。结果表明，发酵过程中苹果酒总酚含量呈现出先升高后下降的趋势，不同学者在对猕猴桃酒、桑葚酒和木瓜酒的发酵过程中总酚含量的研究中也发现了相同的变化规律[39-42]，分析其原因可能是发酵初期酒精发酵营造的乙醇环境促进了酚类物质的溶出，使总酚含量升高，之后酚类物质在发酵过程中被消耗或氧化，使得含量下降；Vc处理组总酚含量明显高于其他组，这可能是由于Vc自身可以与FC试剂反应，增加了765nm处吸光值，导致测得的总酚含量增加，但Vc添加量只有200mg·L-1，而与对照相比其总酚增加量远高于200mg·L-1，因此另一个主要原因就是Vc通过优先自氧化方式保护酚类物质，同时将酚类物质氧化初期产生的邻醌还原为原来的酚类化合物，从而使总酚含量增加；Lys与CA处理组在发酵过程中总酚变化趋势上表现出了异常性，这是由于Lys在发酵前期减缓了酒精的生成速度，阻碍酚类物质从果肉中浸提出来，CA也影响了酚类物质的产生，使总酚含量未出现升高性波动而是持续降低；同时发酵后期总酚含量的持续降低也印证了BENVENUTTIA等[43-44]对苹果酒的研究。

寒富苹果酒发酵过程中的抗氧化能力变化也是寒富苹果酒品质的重要指标，总抗氧化能力越强，越能表现出产品的功能性。本试验用3种方法体现寒富苹果酒的总抗氧化能力，清除DPPH自由基能力方面，寒富苹果酒发酵过程中发酵液的DPPH自由基清除能力总体呈现下降趋势，程拯艮对苹果酒发酵过程中的DPPH能力的测定，发现在0～12d时明显下降，在12～25d时下降缓慢，这与本试验的试验结果的变化趋势类似[45]，李国薇在其对不同苹果品种酿造的苹果酒DPPH自由基清除能力的测定中也发现，发酵过程中清除能力总体会呈下降趋势，清除率在80～95%之间[46]，这一数值也与本实验结果吻合；NaCl与CA抗氧化剂处理能够提高初始的DPPH自由基清除能力，发酵初期CA提供的酸性环境，抑制了酶活性，而NaCl属于强极性分子，可以使酶失活，可能在一定程度上保护了具有抗氧化性的酚类物质不被氧化，从而在初期提高DPPH自由基清除率；Vc处理组在整个过程中都表现出极好的清除能力，同时在发酵结束后，只有Vc处理清除率基本不变，其他处理都有所降低，可能是由于Vc自身作为底物被消耗，保护了酚类物质不被氧化，使发酵液有较强的清除DPPH自由基能力[47]。使用T-AOC法测定发酵液的总抗氧化能力，结果表明，发酵液还原Fe3+呈现先升高后下降的趋势，与总酚含量变化波形一致，发酵初期Vc处理组总抗氧化能力明显高于其他组，这是由于Vc本身具有Fe3+还原特性能力外，还作为氧化底物被消耗保护了酚类物质，提高了发酵液的总抗氧化能力；整个发酵过程，NaCl、GOD与对照处理总抗氧化能力比初期升高，涨幅最大的是NaCl处理，这可能是由于NaCl处理后抑制PPO及其他参与酚类物质后续氧化的酶活性，维持了酚类物质含量，从而提高发酵液总抗氧化能力；同时本试验结果与其他学者的研究变化趋势基本相同，但增长趋势略有差异[46]，这可能是所用苹果原料不同导致的。而各个处理的发酵液清除ABTS+·的能力在发酵过程中，整体呈现下降趋势，下降幅度较小，变化趋势比较平缓，发酵初期各处理组间差异显著，同时Vc处理组的清除ABTS+·能力远高于其他组。总体看来，抗氧化剂Vc的添加对寒富苹果酒发酵过程的抗氧化能力有很大的改观，提高了产品的营养价值。

本研究在寒富苹果酒发酵过程中添加不同抗氧化剂（NaCl、Lys、Vc、CA、GOD），探寻寒富苹果酒发酵过程中营养物质变化规律同时，探究不同抗氧化剂处理对寒富苹果酒发酵过程的影响。寒富苹果酒在发酵过程中会发生一系列物理化学变化，我们直观的看到其发酵液由浑浊逐渐变为澄清，发酵的0～5d寒富苹果酒发酵液上部会出现大量絮状物，而5～15d期间絮状物会陆续下沉，到发酵的20d时絮状物逐渐消失沉到发酵罐底部；与此同时发酵液的可溶性固形物、酒精、总酚等物质含量也发生了变化。抗氧化剂的添加对寒富苹果酒发酵液的可溶性固形物、酒精度影响较小，不影响发酵的正常进行；不同种类抗氧化剂的添加对发酵液颜色有不同的影响，发酵初期发酵液颜色呈现深褐色，添加Vc处理后，发酵液颜色较好，呈黄色；发酵中期发酵液颜色相差无几，呈现黄褐色；而发酵末期一般呈现禾杆黄，此时各处理组差异不显著，添加Vc和CA都能对寒富苹果酒起到护色的效果；添加Vc可显著提高总酚的测定结果，会作为底物参与氧化反应，对酚类物质起到了很好的保护作用；本研究通过测定发酵液在发酵过程中，各组处理清除DPPH能力、T-AOC法的Fe3+还原能力以及清除ABTS+·能力来评价不同抗氧化剂处理对寒富苹果酒抗氧化能力的影响。各处理组清除DPPH自由基的能力整体呈下降趋势，不同处理组的清除DPPH自由基能力变化规律不明显，清除率在94.62%到80.42%之间波动。酒体的Fe3+还原能力在发酵整个过程中都出现先增强后降低的波动现象，其中Vc处理后的发酵液抗氧化能力最强，这与总酚变化规律具有一致性。酒体清除ABTS+·能力在发酵期间总体呈现下降趋势，存在小范围的波动，Vc处理能提高清除ABTS+·能力。综上所述，不同抗氧化剂的使用对寒富苹果酒发酵过程中营养物质及抗氧化活性影响较大的是Vc，同时在寒富苹果酒的护色方面也有较好的表现。因此，未来可以考虑Vc在寒富苹果酒产业上的工业化大批量应用，同时也发现了其他抗氧化剂在寒富苹果酒加工中的不同贡献，在后续研究中可以考虑复合抗氧化剂的使用，全方位优化寒富苹果酒的品质。