胃癌患者血清miR-7、miR-204表达及其与临床病理特征、预后的关系

杨建华，郭晓娟，牛广旭，王静

(邯郸市中心医院，河北邯郸 056001)

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，2008年全球胃癌新发病例约100万，胃癌死亡病例约74万，分别占肿瘤总新发病例数的8%、肿瘤总死亡病例数的10%[1]。目前临床上，手术切除是胃癌较为有效的治疗手段，但近50%患者就诊时处于中晚期，患者5年总生存率并不乐观。研究表明，早期就诊胃癌患者的术后5年总生存率可高达90%[2]，因此早期诊断并采取有效治疗方案，对改善胃癌患者的预后极其重要，而寻找能够预测患者预后的生物标志物，也是胃癌研究领域的热点之一。微小RNA(microRNA)是一类具有调节功能的非编码RNA，作为一种转录后调控因子，microRNA在肿瘤生理病理过程中具有重要的调节功能，如细胞分化、凋亡、增殖和侵袭等[3,4]。研究证实，miR-7在黑色素瘤[5]、结直肠癌[6]、肺癌[7]等多种恶性肿瘤中表达下降，发挥抑癌基因功能；miR-204异常表达与肿瘤细胞增殖、侵袭、化疗耐药相关[8,9]。循环microRNA在血浆中具有较好的稳定性，具有作为无创性诊断、治疗、预测预后血清生物标志物的潜能[10]。本研究旨在通过观察胃癌患者血清miR-7、miR-204表达变化，探讨两者血清水平与患者临床病理特征、预后的关系，以期为胃癌研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年1月～2013年12月在我院就诊的95例胃癌患者(病例组)。纳入标准：术前未接受抗肿瘤治疗；术后经病理检查确诊为胃癌；具备完整的病例资料；完成随访。排除标准：严重肝肾功能不全；全身感染性疾病；免疫系统疾病等。其中男59例，女36例；年龄<60岁48例，≥60岁47例；肿瘤直径<5 cm者46例，≥5 cm者49例；肿瘤低分化53例，中高分化42例；病理类型:腺癌81例，印戒细胞癌6例，黏液癌8例；有淋巴结转移56例，无淋巴结转移39例；TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期62例，Ⅲ～Ⅳ期33例。同期选择体检健康志愿者95例(对照组)，其中男62例，女33例；年龄<60岁45例，≥60岁50例。两组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义。采集病例组患者术前1天、对照组体检时的晨起空腹外周静脉血10 mL，室温静置10 min，2 000 r/min离心5 min，收集上层血清，置于-80 ℃冰箱保存。本研究经本院伦理委员会审核并通过，所有研究对象签署知情同意书。

1.2 血清miR-7、miR-204检测 采用实时荧光定量PCR。采用RNAiso for Small RNA(TaKaRa公司)、氯仿、异丙醇、无水乙醇提取血清总RNA，溶解于焦碳酸二乙酯(Amrsco公司)水中，紫外分光光度计(Eppendorf公司)检测RNA纯度和浓度。采用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)、普通PCR仪(Bio-Rad公司)合成cDNA，反应条件为37 ℃ 60 min、85 ℃ 5 s，将反应产物置于-20 ℃冰箱保存。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)、实时荧光定量PCR仪(Roche公司)进行实时荧光定量PCR，反应条件：95 ℃ 30 s，50个循环(95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s)，95 ℃15 s。PCR引物购自上海生工生物工程股份有限公司，序列如下，U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；hsa-miR-7正向引物：5′-CGGCTGGCCCCATCTGGAAGAC-3′，反向引物：5′-CGATGGCTGGCACCATTAGGTAGAC-3′；hsa-miR-204正向引物：5′-GCGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3′，反向引物：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。以2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达水平，实验重复3次后进行统计分析。

1.3 随访方法 采用电子通讯、门诊复查等方式对病例组患者进行随访，随访时间从术后开始，持续1～60个月，直至患者死亡或者随访时间结束。

2 结果

2.1 两组血清miR-7、miR-204表达比较 病例组、对照组血清miR-7相对表达量分别为0.328±0.116、1.332±0.364，miR-204相对表达量分别为0.376±0.133、1.257±0.324，两组比较P均<0.05。

2.2 血清miR-7、miR-204表达与胃癌临床病理特征的关系 胃癌患者血清miR-7表达与淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分化程度、病理类型、TNM分期无关(P均>0.05)；血清miR-204与肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P均<0.05)，与患者年龄、性别、肿瘤直径、病理类型无关(P均>0.05)，见表1。

表1 血清miR-7、miR-204表达与胃癌临床病理特征的关系

2.3 血清miR-7、miR-204表达与患者预后的关系

2.3.1 血清miR-7、miR-204表达对患者术后5年总生存率的影响 ①血清miR-7相对表达量的中位数为0.345，miR-7低表达组47例、miR-7高表达组48例。miR-7低表达组术后5年总生存率为34.04%、术后中位生存时间为(32.02±3.00)个月，miR-7高表达组分别为58.33%、(47.75±2.58)个月。两组术后5年总生存率比较差异有统计学意义(Log-rankχ2=8.119，P=0.004)，见图1。②血清miR-204相对表达量的中位数为0.412，miR-204低表达组48例、miR-204高表达组47例。miR-204低表达组术后5年总生存率为35.42%、术后中位生存时间为(37.38±2.87)个月，miR-204高表达组分别为57.45%、(44.62±2.97)个月。两组术后5年总生存率比较差异有统计学意义(Log-rankχ2=3.916，P=0.048)，见图1。

图1 血清miR-7、miR-204表达对患者术后5年总生存率的影响(Kaplan-Meier生存曲线)

2.3.2 胃癌患者预后的危险因素 Cox回归模型分析结果显示，有淋巴结转移、较高的TNM分期、血清miR-7低表达、血清miR-204低表达是影响胃癌患者预后的危险因素(P均<0.05)，见表2。

表2 胃癌患者预后危险因素的Cox回归模型多因素分析结果

3 讨论

胃癌是一种来源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，其发生发展是一个多因素、多步骤的进行性过程，饮食习惯、压力、过度疲劳、幽门螺杆菌感染等均是引发胃癌的危险因素[11]。在中国，胃癌死亡病例数约占肿瘤总死亡病例数的25%～35%，已成为一个严重威胁人民生命健康的公共健康问题[12]。

microRNA在常见的临床诊断样本中可被检测并定量。血清循环microRNA是一种良好的非侵入性生物标志物[13,14]。miR-7定位于9号染色体，与多种恶性肿瘤关系密切。miR-7可反向调控YY1蛋白表达，有望成为结肠癌YY1癌基因的抑制剂[15]；miR-7通过下调XIAP表达，促进宫颈癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[16]；而HOTAIR基因可抑制miR-7表达进而逆转乳腺癌干细胞EMT过程[17]。本研究中，胃癌患者血清miR-7水平低于健康体检志愿者，提示miR-7表达降低与胃癌发生相关，miR-7在胃组织中发挥抑癌基因功能，与其在乳腺、结肠组织中功能一致。此外，本研究结果显示，血清miR-7水平与患者存在淋巴结转移相关，提示检测患者血清miR-7水平有利于初步推断胃癌患者是否发生淋巴结转移。Xie等[18]的研究结果证实，miR-7可抑制上皮生长因子受体表达进而抑制胃癌细胞侵袭迁移。淋巴结是肿瘤细胞发生侵袭转移的重要途经，初步推断miR-7可能与胃癌细胞侵袭迁移过程相关，后续研究将在细胞水平对此科学假说进行验证。

研究表明，肺癌[9]、急性髓细胞性白血病[19]等恶性肿瘤中均存在miR-204表达异常。Zhang等[20]发现胃癌组织中miR-204表达受抑制。本研究结果也显示，胃癌患者血清miR-204水平降低，提示miR-204在胃组织中发挥抑癌基因功能。此外，本研究发现血清miR-204水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关。Liu等[21]发现，在胃癌细胞中增加miR-204表达可抑制细胞侵袭、EMT等。上述结果提示血清miR-204水平可能与胃癌患者病情进展有关。血清miR-204水平低可能预示较低的肿瘤分化程度、有淋巴结转移及较高的TNM分期。

有研究证实，外源性增加miR-7能够增强胃癌细胞的化疗敏感性，miR-7低表达可能导致胃癌患者产生化疗耐受，导致化疗疗效低、患者预后差[22]；马小芬等[23]发现miR-204在胃癌组织中低表达且与其恶性生物学行为相关,上调miR-204可通过下调Bcl-2的表达抑制胃癌细胞的增殖。本研究随访结果发现，患者术前血清miR-7、miR-204水平与患者术后5年总生存率有关；Cox回归模型结果提示，淋巴结转移、较高的TNM分期、血清miR-7低表达、miR-204低表达均为影响胃癌患者预后的危险因素，可能与miR-7、miR-204低表达促进胃癌淋巴结转移有关。因此，检测患者术前血清miR-7、miR-204水平有利于初步预测患者预后，血清miR-7、miR-204有可能作为胃癌患者预后预测的靶分子。

综上所述，miR-7、miR-204在胃癌患者血清中表达降低，且均与患者较差的临床病理特征、较低术后5年总生存率有关，血清miR-7低表达、miR-204低表达是影响胃癌患者预后的危险因素，监测患者血清miR-7、miR-204可能有助于评估患者的预后。