BRAF基因V600E突变与甲状腺乳头状癌关系的研究进展

张富全，王兴越，高英堂，孟祥朝

(天津医科大学天津市第三中心医院，天津300170)

甲状腺癌(TC)是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，约占所有甲状腺结节的5%，全身恶性肿瘤的1%[1]。根据WHO病理分型TC主要包括以下四大类：甲状腺乳头状癌(PTC)、甲状腺滤泡状癌(FTC)、甲状腺髓样癌(MTC)和甲状腺未分化癌(ATC)。其中PTC是最常见的病理类型，占TC的90%以上[2]。最新数据显示TC的发病率仍在不断上升，预计占女性恶性肿瘤的4%，排第5位[3]，其中甲状腺微小乳头状癌(PTMC)占主要部分，这与环境的改变、高分辨超声等诊断技术的进步有关。随着分子生物学的进展，越来越多的TC相关基因突变被报道，主要包括BRAF、RAS和TERT等基因突变，以及RET/PTC和PAX8-PPARγ重排、DNA甲基化等[4]，其中BRAF突变是PTC中最常见的，而BRAF突变中以BRAF V600E突变为主，也是研究最多、应用最广泛的。在中国，PTC患者中BRAF V600E突变的阳性率为69.0%～85.3%，且近年来在PTC中的比例还有上升的趋势。现对BRAF V600E突变与PTC的关系及其在临床中的应用进展进行综述，为PTC患者制定个体化精准治疗方案提供参考。

1 BRAF V600E致病机制

BRAF(又称鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1)基因，属于RAF激酶基因家族，位于人染色体7q34，含18个外显子，编码B型有丝分裂原激活的蛋白依赖性激酶(又称为BRAF激酶)，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK信号传导级联反应的重要组成部分，在细胞的分化及增殖中发挥着重要作用[5]。BRAF V600E突变是位于BRAF基因第15外显子的T1799A点突变，导致其编码产物的第600位氨基酸由缬氨酸(V)变为谷氨酸(E)。除罕见的BRAF突变(如:K601E、AKAP9-BRAF、V599ins和V600D+FGLAT601-605ins)外，PTC中90%以上的BRAF突变为V600E。BRAF V600E突变导致RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK通路持续激活，诱导细胞有丝分裂能力增强，最终使细胞异常增殖并诱导肿瘤发生[6]。

还有研究发现，BRAF V600E突变也能引起钠碘转运体(NIS)基因启动子组蛋白的去乙酰化，导致染色质紧实，阻断基因启动子与转录因子的结合，使NIS基因沉默[7]。与未发生突变的PTC组织相比，BRA FV600E突变组织中NIS表达水平较低，使PTC细胞摄碘能力下降，从而导致放射性碘(RAI)治疗效果差，增加了肿瘤的难治性。另外，BRAF V600E突变会促进促甲状腺素受体(TSHR)基因启动子甲基化，导致TSHR沉默或者表达显著下降，使促甲状腺素(TSH)反馈性升高，促进肿瘤细胞的生长[8]。BRAF V600E基因突变协同端粒酶反转录酶(TERT)启动子突变也在PTC的发生中发挥着重要作用，二者共同存在于PTC的比例为7%～8%[10]，其可能的机制是异常激活BRAF V600E-MAPK-FOS-GABP-TERT信号转导通路，经BRAF V600E激酶磷酸化的低聚果糖(FOS)在此通路上发挥了重要作用[24]。此外，BRAF V600E突变通过癌基因MYC以非TERT启动子突变依赖性的方式上调TERT表达同样促进了PTC的发生[9]。Xing等[10]研究发现，同时携带有BRAF和TERT两种突变会导致PTC患者的复发和死亡风险急剧上升。上述研究表明BRAF V600E突变是PTC形成与进展过程中的重要分子改变，为PTC的诊断及靶向治疗提供了理论基础。

2 BRAF V600E在PTC诊断中的应用

随着超声技术的发展，在随机选择人群中甲状腺结节的检出率为19%～67%[11]，TC在甲状腺结节中占5%～10%，因此，术前诊断结节良恶性对于甲状腺结节患者十分重要，可以避免很多诊断性手术，减少手术相关并发症。当前，初步判断结节性质的检查为高分辨超声结合甲状腺影像报告和数据系统(TI-RADS)分级。而术前判断结节良恶性的标准依然是细胞学检查，即细针穿刺活检(FNAB)。目前，FNAB是诊断甲状腺结节的一种较为准确、经济、微创的方法，据报道，FNAB诊断PTC的灵敏度为83%、特异度为92%[11]。但其存在一定的局限性：穿刺样本量过少，不能完全代表肿瘤组织；潜在的背景污染；穿刺到正常甲状腺组织；未穿刺到肿瘤组织等原因，造成诊断不明确及假阴性结果。对于涉及到组织结构异常的滤泡性肿瘤，在细胞学水平无法明确诊断。此项检查也与医师穿刺技巧及病理科医师诊断经验有很大关系。Kim等[12]研究显示，10%～40%的FNAB结果不能明确诊断，其中20%～25%的结节在术后石蜡病理中确诊为恶性肿瘤。

随着TC相关分子生物学的研究进展，大量研究发现BRAF V600E突变只见于PTC和ATC，而在FTC、MTC和良性结节中未见。所以，若能在术前利用FNAB诊断PTC时，同时检测相关基因突变，这将会提高诊断的准确性。研究发现，术前单独应用FNAB诊断PTC的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别是44%、100%、100%、92.9%，联合分子生物学(包含BRAF、RAS、RET/PTC和PAX8/PPAR等，其中以BRAF基因突变最常见)检测后，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别可达到80%、99.7%、97.6%、97.4%，这提示FNAB联合BRAF V600E基因检测可提高诊断的准确度[13]。Zhang等[14]研究也发现，FNAB联合BRAF V600E诊断PTC的准确性要明显高于单独应用FNAB。2014年，一项关于PTC患者FNAB标本联合分子检测的研究指出，虽然分子检测诊断并不优于细胞学，但将二者结合，可以将诊断的准确性从89.57%提高到98.26%[15]。基于这些研究成果，2015年美国甲状腺协会(ATA)发布的癌症管理指南提出,甲状腺结节的患者在细胞学检查不确定时，建议使用分子标志物(如BRAF、RAS、RET基因突变等)进行辅助诊断[16]。2018年NCCN指南中也改变了传统做法并指出：对FNAB诊断不确定的结节，可以重复FNAB或者考虑分子生物学诊断。随着TC相关的基因突变被相继发现，FNAB联合多基因检测的应用可以进一步提高细胞学诊断的准确度，弥补了FNAB诊断的不足，但可能导致假阳性结果，因为有的基因突变(如RAS突变)可见于甲状腺良性肿瘤。

肿瘤细胞游离DNA(cfDNA)由肿瘤细胞坏死或凋亡后释放，或者由肿瘤细胞分泌而进入血液循环。随着关于cfDNA研究的深入，再一次将BRAF V600E突变检测在PTC中的应用提高了一个台阶。Nichols等在26例确诊为PTC的患者术前血浆标本中，检测到8例患者(占30.8%)有BRAF V600E cfDNA。同时，随访其中6例术前存在BRAF V600E cfDNA的患者，均于术后1个月复查，1例术后血浆中可检测到BRAF V600E cfDNA，但水平明显下降，其余5例均未检出BRAF V600E cfDNA。他们认为BRAF V600E cfDNA对PTC的诊断及术后随访有一定作用。韩国学者Kim等[18]对72例PTC患者进行了肿瘤组织DNA和血浆DNA检测，其中49例(68.1%)有BRAF V600E突变，仅3例(6.1%)PTC患者血浆存在BRAF V600E突变DNA，但这3例患者均有侧颈淋巴结转移和肺转移。Lubitz等研究发现，血液中存在BRAF V600E cfDNA的PTC患者经过手术、靶向治疗或131I治疗后，其血液中BRAF V600E水平较治疗前明显下降，且血液中BRAF V600E水平与肿瘤大小、TSH水平、甲状腺球蛋白(Tg)水平或治疗后抽血时间无关，仅与肿瘤的甲状腺外侵犯相关。以上研究结果表明，检测BRAF V600E cfDNA对于PTC的诊断、预测侧颈淋巴结转移和远处转移有一定作用。同时也可以反映部分患者的治疗效果。

结合相关文献，将PTC患者血液中检测BRAF V600E的优势概括如下：与FNAB相比，血液检测更加简便，侵入性更小，同时更廉价、更安全；可避免FNAB对多灶癌穿刺不全面而造成的假阴性结果，提高多灶性PTC患者诊断的敏感性；血液学检测可提供连续的、定量的、可跟踪的信息，对于存在甲状腺球蛋白抗体、非甲状腺全切的患者以及接受BRAF抑制剂靶向治疗的晚期PTC患者，BRAF V600E cfDNA可作为肿瘤标志物用于术后随访和疗效监测[19]。然而cfDNA的量过少，目前的检测技术只能在大约10%携带BRAF V600E突变的PTC患者的血液中检测到BRAF V600E cfDNA，这种较低的敏感性，极大限制了其在临床中的应用[20]。其次，对于血浆BRAF V600E阳性的患者来说，不能除外患者患有黑色素瘤、非小细胞型肺癌、结肠癌等恶性肿瘤的可能，因为该基因突变也可见于上述恶性肿瘤中。BRAF V600E cfDNA突变检测联合cfDNA甲基化和其他基因突变(如：Calca、Cdh 1、TIMP 3、DAPK和RARβ2等)检测也可以进一步提高诊断的敏感性和特异性[20]，但相关研究目前较少，且cfDNA提取和检测的方法也不同，所以，期待未来有更加敏感的检测方式以及多中心、大样本的研究出现，进一步论证cfDNA在PTC诊断当中的作用。在PTC的诊治中，血浆中cfDNA的BRAF V600E突变的检测更方便，且可提供术后连续性随访数据，但目前因提取方法以及诊断的特异性尚需改进，其临床应用仍有局限性。

3 BRAF V600E与PTC临床病理特征及预后的关系

PTC患者经手术治疗后，基于传统的复发风险分层，包括甲状腺腺外或者血管侵犯、中央区或侧颈淋巴结转移、远处转移、肿瘤的组织学亚型等因素，予以相应的TSH抑制治疗或者131I治疗。PTC患者总体预后是乐观的，生存率较高，但对于有侵袭性病理特征的患者，治疗效果并不理想，复发率和病死率较高。所以，如果对这部分患者做到早期识别将会有重要意义。BRAF V600E突变在PTC的各亚型之间发生率不尽相同，其中经典型约为60%，高细胞型约为77%，PTC衍生型约为25%，而滤泡变异型PTC中BRAF V600E突变的检出率仅为0～12%[21]。研究表明，BRAF V600E突变与PTC更具侵袭性的临床病理特征(如多灶性、腺外侵犯、淋巴结转移、远处转移、高TNM分期、放射性碘抵抗以及术后复发率和病死率)呈正相关[22,23]，而与患者年龄、性别的关系仍不明确[24]。Xing等[25]通过一项纳入2 099例患者的多中心研究(随访时间中位数为36个月，IQR为14～75个月)发现，BRAF V600E阳性组复发率为20.9%(213/1 017)，BRAF V600E阴性组复发率为11.6%(125/1082)，HR为1.82(95%CI：1.46～2.28)，在调整了医疗中心、各种常规病理因素、患者性别和年龄的多变量模型中，这种差异仍然是显著的，认为BRAF V600E突变对PTC复发具有独立的预后价值。BRAF V600E突变与PTC肿瘤的大小同样也有联系。在肿瘤直径<20 mm的PTC患者中，BRAF V600E突变率更高，且当肿瘤直径<10 mm时，伴有BRAF V600E突变的肿瘤更具侵袭性，这提示BRAF V600E突变会增加PTMC的不良预后[26]。桥本甲状腺炎是一种常见的甲状腺慢性炎症。研究发现，合并桥本甲状腺炎的PTC患者BRAF V600E突变率较低，同时疾病的侵袭性也更低，提示桥本甲状腺炎可能是PTC的保护因素[27]。2015年ATA发布的成人甲状腺结节与分化型甲状腺癌(DTC)指南把BRAF V600E突变检测作为术前风险分层的参考因素，术前对BRAF V600E突变状态的检测，有助于指导手术方式及术后治疗和随访。BRAF V600E突变检测对PTMC患者的术后随访作用更加明显，因为此类患者TNM分期一般较低，基于传统复发危险风险分层，其复发风险较小，应用BRAF V600E突变检测可以筛选出复发风险较高的PTMC患者。所以，诊断为Ⅰ/Ⅱ期且BRAF V600E突变阳性的PTC患者将会得到更为积极的治疗和随访。

目前，BRAF V600E突变对PTC患者预后是否有影响仍有很多不同的观点。有文献明确指出BRAF V600E和不良预后相关[24]，也有研究者[28]认为它只是侵袭性因素，而不是真正的预后因素，因为在双变量分析中，它与侵袭性特征和病死率显著相关，当分析中加入其他临床变量时，比如年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期，相关性消失。这些研究的不一致处可能是因为选取研究对象的疾病处于不同的阶段以及所采用的实验方法不同等，因此，仍需要更深入的研究来证实BRAF V600E突变检测是否可以作为一个判断预后的标志。

4 BRAF V600E在PTC治疗中的应用

PTC的治疗方式以手术切除为主，也是最重要的治疗方式。术后辅以TSH抑制或放射性碘治疗，可以使PTC患者的5年生存率达到97.8%。但对分化较差、放射性碘抵抗、复发及转移性PTC患者的治疗效果并不理想，因此需要更为有效的治疗方式。靶向治疗是近年来出现的新型治疗方式，逐渐被用于治疗难治性甲状腺癌，并取得了一定的疗效。BRAF V600E突变就是其中一个重要的靶点，用于治疗BRAF V600E突变的PTC患者的靶向药物主要包括BRAF V600E抑制剂和酪氨酸激酶受体拮抗剂(TKI)，见表1。目前，BRAF V600E抑制剂已经很成熟的应用于黑色素瘤的治疗当中，在PTC治疗方面，研究较多的主要是威莫菲尼和达帕菲尼。2016年，一项入组51例来自10个不同机构的复发或转移性RAIR-PTC患者，给予960 mg威莫菲尼，每天2次，平均随访18.8个月，结果显示患者的总缓解率为38.5%，35%的患者病情稳定至少6个月，73%患者达到疾病控制[29]。威莫菲尼的主要不良反应包括疲劳、体质量减轻、畏食、关节痛、脱发、皮疹、手足综合征、腹泻、发热、口干、恶心以及疣状角化病。同时，针对达帕菲尼的研究也在逐渐增多并且显示出较好的发展前景。BRAF V600E抑制剂的耐药性限制了其临床疗效，其耐药性的产生主要是由于ERK信号通路的激活，从而导致患者在短时间内耐药。对于BRAF V600E野生型的PTC患者，BRAF V600E抑制剂有刺激其增长的可能[30]，其机制可能是其通过刺激RAS的表达，促进肿瘤细胞的生长和转移。所以，对于BRAF V600E野生型的癌症患者，包括RAS突变的患者，是BRAF抑制剂治疗的禁忌。

表1 PTC相关分子靶向药物

索拉菲尼和乐伐替尼已经被FDA批准用于BRAF V600E突变阳性的PTC患者的治疗，两者都属于多靶点TKI。一项纳入417例碘治疗失败的复发或转移性DTC患者的研究显示，接受索拉非尼治疗的患者与安慰剂组相比，索拉非尼可以延长DTC患者的无进展生存期(PFS)多达5个月，明显改善了转移性RAIR-DTC患者的生存情况[31]。2015年，一项纳入21个国家的392例碘治疗失败的复发或转移性DTC患者的研究显示，乐伐替尼组患者的总缓解率为64.8%，明显高于安慰剂组的1.5%(P﹤0.001)[32]。一项关于凡德他尼的多中心、随机对照的Ⅲ期临床试验显示，与安慰剂治疗的患者相比，接受凡德他尼治疗的患者PFS对比安慰剂组显著延长(30.5个月vs 19.3个月)[33]。TKI的严重或致命毒副作用包括皮肤毒性、出血、高血压、脑卒中和肝脏毒性，然而，大多数毒副作用可以通过停止使用药物来控制和逆转[34]。

此外，还有研究显示，与BRAF V600E抑制剂单药治疗相比，BRAF V600E抑制剂和MEK抑制剂二者联用治疗效果要更好，二者联用不仅可以提高患者PFS，并且还可以减轻不良反应[30]。在黑色素瘤的治疗中，二者联用的疗效已经得到证实。2018年NCCN指南提出，对于BRAF V600E阳性的PTC患者，可以联用BRAF V600E抑制剂达帕菲尼和MEK抑制剂曲美替尼。同时，乐伐替尼和索拉菲尼被推荐用于放射性碘抵抗的患者，而重新获得摄碘能力。故对于晚期PTC或分化较差TC患者，推荐分子学检测，指导靶向用药。

BRAF V600E突变是PTC最常见的基因突变，在术前诊断、治疗、危险分层等方面已初步展现出令人鼓舞的结果，但是否可以指示预后，仍然存在争议，需进一步的研究。靶向药物的研究是目前研究热点，不良反应及耐药性是其局限性，后续仍需要更多的研究，或许可以多药联用，以提升效果。在血浆cfDNA方面，目前检测技术的敏感性还较低，期待有更加敏感的检测技术出现，会为术前诊断和术后随访带来深远影响。因此，还需要广大学者及医疗中心对BRAF V600E突变进行更深入的研究，指示并验证其临床应用价值。