LncRNA LIFR-AS1过表达对非小细胞肺癌细胞生物学性能的影响

林忠琨，李锴男，王雷

(山东省立第三医院，济南 250031)

肺癌已成为全球致死率最高的肿瘤[1～3]，尽管治疗已取得了很大进步，但患者术后的复发率仍然较高，预后较差[4～6]。目前非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展的确切分子机制尚不完全明确。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度大于200 nt，缺乏开放阅读框，不参与蛋白质编码的RNA[7]。已有研究表明，LncRNA可以通过影响RNA的转录、剪切、降解和翻译等生物学过程，从而影响细胞的增殖和转移[8]。许多研究发现LncRNA的异常表达与NSCLC的发生和进展密切相关[9,10]。白血病抑制因子受体反义RNA-1(LIFR-AS1)是一种新的肿瘤相关LncRNA，其在NSCLC细胞中的表达及其与细胞增殖、凋亡和转移之间的关系尚不明确。2018年7月～2019年7月，本研究观察了LIFR-AS1在正常细胞及NSCLC细胞中的表达情况，并进一步探讨了LIFR-AS1对A549细胞增殖、凋亡、侵袭、转移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 NSCLC细胞(A549、H226、SPCA1和H358)以及正常人支气管上皮细胞(BEAS-2B)购于中国科学院上海生命科学研究所。引物均由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成；pcDNA3.1、pcDNA3.1-LIFR-AS1(上海吉玛制药技术有限公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；TRIzol(美国Invitrogen公司)；Lipofectamine2000转染试剂盒(Thermo Fisher公司，美国)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa公司，日本)；CCK-8试剂盒(Biosharp公司，中国)；SYBRGreen qPCR Master Mix(TaKaRa公司，日本)；AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒(BD公司，美国)；Dual-LuciferaseTM(Promega,美国)。

1.2 细胞培养 BEAS-2B细胞在BEGM培养基中进行培养。A549、H226、SPCA1和H358在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中培养。所有细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。

1.3 细胞中LIFR-AS1表达检测 采用实时荧光定量PCR法。按照TRIzol说明书中RNA提取方法提取A549、H226、SPCA1、H358以及BEAS-2B细胞的总RNA。逆转录参照PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒说明进行，将1 μg RNA逆转录成cDNA。按SYBRGreen试剂说明进行PCR扩增。引物序列如下：LIFR-AS1上游引物为5′-TGGCCTCGGTTTTCTAGCAG-3′；下游引物为5′-TGTGCCGAAGAGAACACCAT-3′；GAPDH上游引物为5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACA-3′；下游引物为5′-ATGACAAGCTTCCCGTTCTC-3′。PCR反应体系如下：1 μL cDNA，上下游引物各0.5 μL，10 μL SYBR Premix Ex Taq，8 μL ddH2O。反应条件：95 ℃下进行预变性5 min，之后在95 ℃(15 s)、60 ℃(34 s)条件下进行40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。实验重复3次，取平均值。A549、H226、SPCA1、H358和BEAS-2B中LIFR-AS1的相对表达量分别为0.91±0.02、1.21±0.04、1.24±0.05、1.15±0.02和1.96±0.05，NSCLC细胞中LIFR-AS1相对表达量均低于BEAS-2B细胞(P均<0.05)。A549细胞的LIFR-AS1表达量最低，选择A549细胞进行后续实验。

1.4 细胞转染 取2×105个A549细胞，将其接种于24孔培养板，加入500 μL不含抗生素的完全培养基培养过夜。取5 μL Lipofectamione2000置于250 μL Opti-MEM培养基中，混匀室温静置5 min。分别取1 μg的pcDNA3.1-NC或pcDNA3.1-LIFR-AS1置于250 μL的Opti-MEM培养基中，然后把含Lipofectamione2000的Opti-MEM培养基分别与含pcDNA3.1-NC或含pcDNA3.1-LIFR-AS1的Opti-MEM培养基混匀，室温静置25 min。将质粒混合液分别加入每孔的细胞中，轻轻混匀，放培养箱中培养，分别标记为pcDNA-NC组和pcDNA-LIFR-AS1组。12 h后更换含10%胎牛血清的完全培养基。48 h后使用实时荧光定量PCR法检测转染效率，结果如下：pcDNA-LIFR-AS1组LIFR-AS1相对表达量为5.34±0.22，高于pcDNA-NC组的0.93±0.03(P<0.05)，可进行后续实验。

1.5 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。转染48 h后，胰酶消化pcDNA-NC组和pcDNA-LIFR-AS1组A549细胞，制成单细胞悬液。取100 μL细胞悬液，以每孔1 000个细胞的标准种到96孔板中，将所有细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行常规培养。分别培养0、24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8，在培养箱中孵育1 h后，使用酶标仪检测450 nm处的OD值，重复3次，取平均值。细胞增殖率=OD值(24、48、72 h)/OD值(0 h)×100%。

1.6 细胞凋亡检测 采用AnnexinV-FITC法。用不含EDTA的胰酶对转染48 h后的pcDNA-NC组和pcDNA-LIFR-AS1组的A549细胞进行消化；取5×104个细胞，加入Binding Buffer让细胞重新悬浮并将其转移到流式管中；加入5 μL的AnnexinV-FITC到流式管中，混匀后于室温避光条件下孵育15 min，上机前5 min加入5 μL PI进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复3次，取平均值。

1.7 细胞迁移与侵袭能力检测 采用Transwell法。将质粒转染48 h后的pcDNA-NC组和pcDNA-LIFR-AS1组的A549细胞用无血清培养基制备成单细胞悬液，然后将100 μL细胞悬液加入到Transwell小室的上室中。下室中加入500 μL含10% FBS的完全培养基。将小室置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，取出小室，用棉签擦掉上室中残余的细胞，PBS洗小室1遍，使用4%多聚甲醛固定，0.1%的结晶紫染色。PBS洗后，在显微镜下随机选取5个视野，对其进行拍照观察以及计数。当检测细胞的侵袭能力时，首先将Matrigel胶按1∶8稀释，然后包被Transwell小室底部膜的上室面，置37 ℃培养箱30 min，使Matrigel聚合成凝胶，然后将100 μL细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，进行后续的细胞穿梭实验。

2 结果

2.1 LIFR-AS1过表达对A549细胞增殖的影响 见表1。

表1 过表达LncRNA LIFR-AS1对A549细胞增殖的影响

注：与pcDNA-NC组相比，*P<0.05。

2.2 LIFR-AS1过表达对A549细胞凋亡的影响 pcDNA-NC组、pcDNA-LIFR-AS1组细胞凋亡率分别为(3.18±0.21)%、(10.78±1.23)%，两组相比P<0.05。

2.3 LIFR-AS1过表达对A549细胞迁移和侵袭能力的影响 pcDNA-NC组和pcDNA-LIFR-AS1组细胞迁移数分别为(228±25)、(108±18)个，细胞侵袭数分别为(325±30)、(210±28)个，两组相比P均<0.05。

3 讨论

LncRNA尽管没有编码蛋白质的功能，但其通过调控相关功能基因的表达，对细胞增殖、凋亡、衰老和迁移等细胞学行为产生一定的影响[11]。Cui等[12]发现，LncRNA SNHG1通过靶向miR-101-3p/Wnt/β-catenin信号通路促进NSCLC的迁移和侵袭。LncRNA MALAT1通过miR-206调控Akt/mTOR通路，促进NSCLC的增殖、迁移和侵袭[13]。LncRNA UCA1通过海绵吸附作用调控miR-193a-3p从而促进NSCLC的进展[14]。因此，LncRNA作为重要的调控因子，已成为NSCLC的研究热点。

LIFR-AS1是与肿瘤进展密切相关的一种新的LncRNA，它以反义的方式从人类染色体5p13.1上的LIFR基因中转录出来[15]。最近的研究表明LIFR-AS1的异常表达与某些肿瘤的发病及预后密切相关。Okamura等[16]的研究发现LIFR-AS1可以抑制肝癌细胞的增殖和迁移，是肝癌不良预后的重要指标。但是LIFR-AS1在NSCLC细胞中的表达及其对NSCLC细胞生物学行为的影响尚未见报道。本研究首次探讨了LIFR-AS1在NSCLC细胞中的表达及其在NSCLC进展中的作用。

本研究结果表明LIFR-AS1在NSCLC细胞(A549、H226、SPCA1和H358)中的表达低于正常细胞(BEAS-2B)。当在NSCLC细胞A549中过表达LIFR-AS1，LIFR-AS1可以抑制A549细胞的增殖、促进细胞的凋亡。细胞的无限增殖和凋亡受阻是肿瘤细胞的主要特征，LIFR-AS1表达下调可能是引起NSCLC细胞无限增殖的原因之一。侵袭和转移是造成绝大多数肿瘤相关死亡的重要原因，本研究进一步观察了LIFR-AS1过表达对A549细胞迁移和侵袭的影响，结果表明过表达LIFR-AS1可以明显抑制A549细胞的迁移和侵袭能力，这就说明LIFR-AS1在控制NSCLC转移过程中发挥重要作用。以上研究表明在NSCLC细胞中LIFR-AS1可以作为抑癌基因发挥作用，但是LIFR-AS1影响NSCLC细胞生物学行为的分子机制尚不明确。Xu等[17]研究发现LIFR-AS1可以与miR-197-3p相互作用，上调肿瘤抑制基因Sufu的表达，从而抑制乳腺癌细胞的生长和增殖。此外，Liu等[15]发现LIFR-AS1可以作为竞争性内源RNA与miR-29a相互作用，下调TNFAIP3的表达，从而降低结肠癌治疗中对PDT的抗药性。对于NSCLC细胞中LIFR-AS1发挥作用的具体分子机制将是我们以后的研究方向。

综上所述，NSCLC细胞中LIFR-AS1表达下调，过表达LIFR-AS1可以抑制NSCLC细胞的增殖和迁移侵袭能力，促进细胞凋亡。LIFR-AS1有可能成为NSCLC诊断和治疗的新靶点。