补脾益肾起痿汤对实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠模型免疫机制的影响

张运克，刘冲冲，王晓含

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；3.北京中医药大学，北京 100029)

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种涉及细胞免疫和体液免疫等多病机的自身免疫性疾病[1-3]，其主要病理损害在神经肌肉接头处的突触后膜，且发病机制复杂[4]，主要由体液免疫介导的乙酰胆碱受体(AChR)抗体及补体系统参与而起病。补脾益肾起痿汤由补中益气汤合二仙汤加减化裁而成，是全国第三、四批名老中医郑绍周教授治疗重症肌无力的常用方剂，经多年的临床实践与观察，对脾肾亏虚型的肌无力患者治疗有效率高达80%。为探索本方治疗MG的作用机制，我们通过人工合成免疫原法构建EAMG大鼠模型，分别应用抗原包被法、免疫光比浊法检测大鼠血清中AChR-Ab的水平变化及血清总IgG、补体C3、TGF-β1的浓度变化，初步探讨了补脾益肾起痿汤治疗MG的免疫学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

于北京维通利华实验动物技术有限公司采购健康LEWIS雌性大鼠60只，年龄42～62天，体质量150～160 g，合格证号：11400700140544。大鼠饲养在河南省医药科学研究院SPF级实验动物中心进行。采用随机数字表法将大鼠分为补脾益肾起痿汤高中低3个剂量组、西药(强的松)组、模型组及空白对照组共6个组，每组大鼠各10只。

1.2 实验仪器及试剂

人工合成鼠源性AChR-α亚基97～116肽段序列免疫原：购自上海淘普生物科技有限公司，规格：6 mg/支，分子量：2252.62，纯度：98.67%，序列号：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI(20aa)；完全福氏佐剂(CFA)、不完全福氏佐剂(IFA):购自美国Sigma公司,规格：10 mL/瓶，CFA货号：F-5881，IFA货号：F-5506；磷酸盐缓冲液(PBS)：购自北京索莱宝科技有限公司；大鼠/TGF-β1 ELISA试剂盒：购自北京达科为生物技术有限公司；大鼠/补体C3、大鼠/总IgG ELISA试剂盒：购于南京建成科技有限公司；iMark酶标仪：购自北京友华照钦医疗器械有限公司。

1.3 实验药物

补脾益肾起痿汤方剂组成：黄芪50 g，生白术15 g，党参20 g，升麻15 g，柴胡15 g，陈皮10 g，当归15 g，炙甘草15 g，仙茅15 g，仙灵脾15 g。将上述药物浓煎至生药浓度为0.74 g/mL。

醋酸泼尼松片：购自郑州大学第一附属医院河医院区，货号：H33021207。

1.4 实验模型制备

参考许文华[5]免疫乳剂的制备构建实验模型。首次免疫:按照1∶1.5∶1.5的比例将R97～116、CFA、PBS三者充分混匀，于造模组大鼠足垫部、鼠背部多点注射200 μL乳剂(含100 μg R97～116)，于对照组大鼠注射同等剂量的CFA与PBS混合乳剂。第二次及第三次免疫：按照1∶1∶1的比例将R97～116、IFA、PBS三者充分混匀，在首次免疫后的第30天及第45天,取200 μL乳剂(含100 μg R97～116)于造模组大鼠强化接种。

三次免疫结束后每隔2天对大鼠进行肌力测定。依据Lennon[6]分级法将大鼠肌力分为4级，0级：没有肯定肌无力的表现，记0分；1级：休息时无明显异常，但四肢力量较弱，前肢乏力易疲劳，记1分；2级：休息时无精打采，抓握4～5次出现前肢无力，且动作欠协调，毛发不泽，记2分；3级：较重肌无力表现，抓握不能，呼吸喘粗，肌肉震颤，甚至死亡，记3分，严重者记4分。若症状介于两级之间则记为0.5、1.5、2.5分，且数值可随肌力表现上下浮动。

1.5 给药方法

各组大鼠分别连续灌胃4周。其中补脾益肾起痿汤低、中、高浓度组大鼠分别按16.2 mg/(kg·d)、32.4 mg/(kg· d)、64.8 mg/(kg·d)剂量给予实验药物灌胃，西药组大鼠给予醋酸泼尼松片5.4 mg/(kg·d)，模型组与空白组大鼠给予生理盐水3 mL/d。

1.6 实验指标的测定

1.6.1 新斯的明试验

从免疫后第50天的造模组大鼠中随机选取5只，给予新斯的明试验以观察大鼠肌力的改变情况。新斯的明按照37.5 μg/kg的剂量予腹腔注射,同时予阿托品15 μg/kg腹腔注射拮抗新斯的明毒蕈碱样反应。若12 min后大鼠活动明显增加，抓握时肌力明显改善，症状改善状态持续2～12 h，则为新斯的明试验阳性。

1.6.2 重复神经电刺激测肌电图

将经过腹腔注射麻醉后的大鼠固定于平板上，切开腓肠肌并暴露坐骨神经，并将记录电极、刺激电极分别置于腓肠肌和坐骨神经上,然后用电生理记录仪记录复合动作电位振幅，电极刺激频率分别为5 Hz和10 Hz，刺激部位为坐骨神经，检测完成后予创口处缝合并予青霉素外敷预防感染。衰减值用第5个动作电位与第1个动作电位的变化百分比表示。

1.6.3 血清中AChR-Ab、TGF-β1、补体C3及IgG水平测定

取大鼠腹主动脉血约5 mL，离心机10 000转/min离心15 min，EP管每管120 μL分装并放置于-20℃冰箱保存。血清使用前10 h放于4℃冰箱缓慢解冻，若有沉淀则快速离心1 min，然后采用抗原包被法测定大鼠血清中AChR-Ab水平，采用免疫光比浊法测定大鼠血清中TGF-β1、补体C3、IgG水平。

1.7 统计学方法

2 实验结果

2.1 各组大鼠Lennon评分与血清AChR-Ab浓度

模型组大鼠表现为前肢抓握乏力，嘶咬咀嚼无力，体质量增长较缓慢或减轻，毛发不荣，空白组大鼠则无明显异常。对各组大鼠进行血清AChR-Ab浓度测定，并对模型组大鼠首次免疫50天后进行肌力测定，其中评分小于1分、1分至1.5分之间、1.5分至2分之间、2分以上的大鼠分别有4只、3只、20只、23只。

见表1。在肌力评分方面，空白组低于模型组，具有统计学意义(P<0.01)，说明模型组大鼠肌力明显减退，EAMG大鼠模型制作成功；在血清AChR-Ab(OD值)方面，空白组低于模型组，具有统计学意义(P<0.05)。

表1 大鼠肌力评分与血清AChR-Ab浓度结果

注：与空白组相对比，▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.2 新斯的明试验

大鼠行新斯的明试验12 min后，观察到其精神状态明显好转，活动明显增多，肌力明显提高。见表2。模型组Lennon评分高于空白组，具有统计学意义(P<0.05)。

表2 模型组大鼠在注射新斯的明前后Lennon评分比较分)

注：与注射前评分相比，△P<0.05

2.3 重复神经电刺激检测肌电图

从造模组大鼠中随机选取5只行肌电图检查，衰减值用第5个动作电位对第1个动作电位的变化百分比表示，其大于10%。见图1及表3。

A EAMG1号

B EAMG2号

C EAMG3号

D EAMG4号

E EAMG5号

F 正常组

表3 肌电图波值(图1)

注：图EAMG1-5组第五波与第一波波值相比电位衰减值>10%，图1正常组电位基本无变化

2.4 各组大鼠血清中TGF-β1、补体C3、IgG浓度比较

见表4。与空白组相比较，模型组大鼠血清中TGF-β1及补体C3浓度均显著降低(P<0.01)，应用西药及高中低浓度剂量中药治疗后，TGF-β1及补体C3浓度均有一定程度的升高，与模型组相比较，均具有统计学意义(P<0.01)；与西药组相比较，高中低浓度剂量中药治疗后TGF-β1及补体C3浓度均降低，但不具有统计学意义(P>0.05)。

与空白组相比较，模型组大鼠血清中IgG浓度明显升高(P<0.01)，应用西药及高中低浓度剂量中药治疗后，IgG浓度有一定程度的降低，与模型组相比较，具有统计学意义(P<0.01)；与西药组相比较，高中低浓度剂量中药治疗后IgG浓度增高，但不具有统计学意义(P>0.05)。

表4 各组大鼠血清中TGF-β1、补体C3、IgG浓度比较

注：与空白组相比较，△P<0.01;与模型组相比较，●P<0.01

3 讨论

重症肌无力是一种由体液免疫介导、细胞免疫依赖及补体参与的疑难性自身免疫性疾病，主要针对神经肌肉接头 (neuromuscular junction，NMJ)突触后膜的AChR，其中约74%～88%的全身型MG患者AChR抗体呈阳性[7-8]。IgG抗体能促进单核巨噬细胞的吞噬作用，是体液免疫应答中的关键因子，其亚型包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，以IgG1和IgG3亚型为主的AChR抗体与突触后膜AChR结合后可激活补体系统[9-10]，使NMJ处沉积大量补体，并形成膜攻击复合物 (membrane attack complex，MAC)，导致补体溶解，AChR被破坏、内吞，从而造成NMJ传递功能障碍，因此MG发病与补体系统的激活密切相关。补体因子可辅助或增强抗体分子，对机体的防御及免疫系统功能的调节至关重要，补体C3处于补体经典激活途径和旁路激活途径的汇合点，且是补体系统中含量最高、最重要的成分，有着重要的生物学功能[11-12]。C3被激活后裂解产生的大片段C3b与细胞表面结合形成C5转化酶，C5裂解产生的大片段C5b与C6～9形成C5b-9复合物，剩余部分在细胞表面结合形成MAC，从而溶解细胞[13]。补体系统活化状态与补体活化产物循环有关[14]，有研究发现小鼠被敲除C3基因后，无法成功构建EAMG模型，AChR抗体水平亦随之降低，正常状态下AChR抗体水平与B细胞数量及细胞因子表达密切相关，C3基因缺失小鼠NMJ突触后膜上存在IgG沉积，但无补体C3和MAC，表明C3基因缺失可影响MAC介导的免疫损伤，亦可调节免疫系统，从而降低小鼠自身免疫反应的机率[15]。在自身免疫性炎性反应过程中TGF-β1可发挥多种作用[16]：①T、B淋巴细胞功能可被抑制；②可衰减或抑制炎性反应，起负性调节；③可拮抗细胞炎性因子TNF-α，减少细胞间黏附分子的表达，使免疫下调，促进炎症修复。有报道发现[17]TGF-β1含量在EAMG大鼠血清中较正常组低，且疾病严重时下降幅度更大。

补脾益肾起痿汤由补中益气汤合二仙汤君药组成，对辨证属脾肾亏虚型肌无力(痿证)临床疗效显著，遵循“治痿独取阳明”原则。补中益气汤是补益脾胃代表方，其功效为补益中气、升阳举陷，研究表明由补中益气汤化裁的益气升提方[18]可以减轻由Rα97-116免疫Lewis大鼠构建的EAMG模型的临床症状，其可能通过提高TGF-β含量而发挥疗效。梁丽萍等[19]报道补中益气汤通过降低IgG、升高补体C3的浓度治疗气虚发热，张富强[20]报道：补中益气汤可通过药物间相互作用调节体液免疫应答，进而抑制AchRAb的产生，减轻神经肌肉接头功能损害，缓解肌无力症状。脾胃亏虚日久，造成肾阳亏虚，故加二仙汤君药仙茅、仙灵脾，达到脾肾双补作用。仙茅、仙灵脾可上调脾细胞培养上清中IL-1、IFN-γ及IL-5的含量[21]。徐鹏等[22]报道：补脾益肾药物可以通过调控免疫相关细胞因子的变化，改善EAMG动物的临床症状。对本研究结果分析发现补脾益肾起痿汤通过下调人工合成免疫原制作实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠模型血清总IgG，上调TGF-β1、补体C3水平表达，降低血清AChR-Ab浓度，从而发挥免疫调节功能，减轻肌无力症状。本研究从免疫调节角度探讨补脾益肾方剂治疗重症肌无力的作用机理，这为中药复方治疗重症肌无力提供了新的思路。