类风湿关节炎患者外周血中Th17细胞及IL-17与DAS28的相关性分析

侯雷 元晓龙 马武开Δ 姚血明 陆道敏 宁乔怡 曾苹 周静

(1.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550003；2.林州市人民医院，河南 林州 456550)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性进展性自身免疫性疾病，临床表现以对称性、侵蚀性及多关节炎为主要特点，其基本病理表现为滑膜炎及血管翳的形成。RA是临床上常见的难治性风湿类疾病，在我国的发病率为0.42%，且致残率较高[1]。RA具体的发病机制仍不清楚，目前较为一致的观点认为，RA的发病与体内辅助性T细胞17(helper T cells 17，Th17)及白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)的表达有关[2-3]。Th17细胞是机体中一种新型的辅助性T细胞，是导致RA发生的关键性免疫应答细胞，而IL-17是Th17细胞发挥免疫调节作用的主要效应因子，具有强大的致炎作用[4-5]。临床上观察RA患者常用判断病情的活动指标是28个关节疾病活动度评分(disease activity score-28，DAS28)，但RA患者DAS28评分不同活动度与Th17细胞及IL-17之间关系的研究却很少。因此，本研究通过观察RA患者28个关节的关节肿胀数(swollen joint count，SJC)、关节压痛数(tender joint count，TJC)、疼痛视觉模拟评分(Visual Analogue Score，VAS)、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)来计算DAS28评分，探讨其与RA外周血中Th17细胞及IL-17的相关性，以期为RA的临床治疗及IL-17靶向药物的研发提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 RA患者120例均选取于2017年6月至2017年12月在我院风湿科住院期间确诊的患者，其中男9例，女111例，年龄18～70岁，平均年龄(52.32±10.17)岁，病程1月～26年，平均(59.73±11.28)月。健康对照组30名均来源于同期在我院体检中心体健的健康人群，其中男11例，女19例，年龄18～60岁，平均年龄(46.25±14.55)岁。纳入标准：RA组：符合2010年ACR/EULAR联合制定的RA分类诊断标准；年龄在18～70岁；未伴有其它风湿免疫性疾病者；患者知情同意。健康对照组：实验室检测各项指标均在正常范围内，且无慢性疾病史者。排除标准：不符合上述RA纳入标准者；伴有急慢性感染和恶性肿瘤者；伴有严重肝肾功能不全和心脑血管疾病者。

1.2诊断标准 120例RA患者均符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟(ACR/EULAR)联合制定的RA诊断分类标准[6]。

1.3临床观察指标 制作RA患者临床指标观察表，包括28个关节的SJC、TJC，VAS，ESR；运用DAS28-ESR公式计算DAS28评分[7]，并根据DAS28评分分为缓解期组17例(DAS28≤2.6)、低度活动组22例(2.65.1)。

1.4实验试剂及仪器 人淋巴分离液、无菌PBS缓冲液、流式染色缓冲液、人IL-17酶联免疫ELISA试剂盒96T(以上均购自昆明绿盟科技有限公司)；Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human IL-17A单克隆抗体、同型阴性对照Alexa Fluor 647 Mouse IgG1 K Isotype control抗体、FITC Mouse Anti-Human CD3单克隆抗体、破膜剂Fixation/Permeabilization Solution Kit RUO、刺激阻断剂Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug、PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD8单克隆抗体(以上均购自美国BD公司)。BD FACSCanto II型流式细胞仪(购自美国BD公司)；酶标分析仪、洗板机(均购自深圳市凯特生物医疗电子科技有限公司)；台式低速离心机(购自长沙平凡仪器仪表有限公司)；CO2培养箱(购自上海华连医疗器械公司)；电热恒温水浴箱(购自北京医疗设备厂)。

1.5流式细胞术(FCM)检测外周血中Th17细胞表达的百分率 取2 mL新鲜肝素抗凝血与2 mL 无菌PBS缓冲液混匀置入无菌流式管中，再加人淋巴分离液4 mL，4 ℃避光2 000 r/min，离心20 min，吸取中间乳白色样单核细胞层(PBMC)，加无菌PBS缓冲液配置成250 μL PBMC；加2 μL 250x刺激阻断剂，混匀，5% CO2培养箱37 ℃培养4 h；加20 μL FITC-CD3单克隆抗体及5 μL PerCP-CD8单克隆抗体，混匀，室温避光30 min；加1 mL 破膜剂，混匀，室温避光30 min；加1 mL无菌PBS缓冲液，混匀，4 ℃避光1 500 r/min，离心5 min，弃上清；再加1 mL无菌PBS缓冲液，混匀，将细胞液平均分为两管，分别加Alexa Fluor - IL-17A单克隆抗体、同型阴性对照Alexa Fluor- IgG1 K抗体20 μL ，4 ℃ 避光30 min后加流式染色缓冲液1 mL，4 ℃避光1 500 r/min，离心5 min，弃上清；重复洗涤2次后加无菌PBS缓冲液500 μL，充分重悬后上流式细胞仪检测分析Th17细胞(CD3+CD8-IL-17+)表达的百分率。

1.6ELISA法检测血清IL-17表达的浓度 清晨空腹采集外周静脉血5 mL，采集后3 000 r/min离心10 min分离血清，置于无菌EP管-20 ℃冰箱保存备检；检测时严格按照人IL-17酶联免疫ELISA试剂盒说明书上的步骤检测血清IL-17表达的浓度。

2 结 果

2.1一般情况 RA患者不同分组间在性别、年龄及病程上差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1 不同分组间性别、年龄、病程的关系

注：不同RA分组间两两相比，P均>0.05。

2.2不同RA分组间SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28的比较 SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28在各组中差异均有统计学意义(P均<0.05)；SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28由高到低依次为：高度活动组>中度活动组>低度活动组>缓解期组，见表2。

表2 不同RA分组间SJC/TJC/VAS/CRP/DAS28的比较

注：不同RA分组间两两相比，P均<0.05。

2.3不同分组间Th17细胞、IL-17表达水平的比较 与健康对照组比较，RA患者各组Th17细胞、IL-17表达水平均明显升高，且两两组间比较均有统计学差异(P均<0.05)。Th17细胞、IL-17的表达水平依次为高度活动组>中度活动组>低度活动组>缓解期组>健康对照组，见图1-8、见表3。

表3 不同分组间Th17细胞、IL-17表达水平的比较

注：不同分组间两两相比，P均<0.05。

2.4不同RA分组间Th17细胞、IL-17表达水平与DAS28评分的相关性 结果显示：缓解期组、低度活动组、中度活动组及高度活动组与RA患者外周血中Th17细胞及IL-17表达水平均呈正相关关系，见表4。

表4 不同RA分组间Th17细胞、IL-17表达水平与DAS28评分的相关性

3 讨 论

RA是由多种炎症因子共同参与，导致关节滑膜增生和血管翳形成，对关节滑膜及软骨造成侵犯破坏的无菌性炎症反应疾病，并最终可引起关节畸形及活动明显受限，从而严重影响RA患者的日常生活质量。至今RA的发病具体机制还不完全清楚，但最新的研究提示RA患者外周血中T淋巴细胞亚群变化异常往往是其发病的重要原因。例如，研究发现RA的发病与体内Th17细胞及IL-17的表达有关，在大量小鼠胶原诱导关节炎的研究中表明：Th17细胞效应因子IL-17具有很强的致炎作用，是RA发病的重要原因[8-10]。

Th17细胞是机体中一种新型的辅助性T细胞，主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-22、IL-23和TNF-α等细胞因子，但以分泌IL-17为主要特征。IL-17是近年来新发现的一个白介素家族成员，主要是由活化的记忆性CD4+T淋巴细胞亚群分泌而来[11-12]，尤以Th17细胞分泌IL-17A为主，其参与了RA的发病及病情进展，并具有强大的致炎作用，因此成为一个研究的热点[13-15]。已有研究明确IL-17可以诱导产生TNF-α及IL-1、IL-6等炎症因子，这些炎症因子可以促进并激发Th17细胞的活化，从而加大炎症反应的表达[16]。IL-17还能够促进破骨细胞和滑膜成纤维细胞的活化和增殖。研究发现，IL-17能刺激RA 患者外周血单核细胞向破骨细胞分化，健康人外周血CD4+单核细胞经巨噬细胞集落刺激因子和IL-17共同刺激后，其向破骨细胞分化的能力及破骨细胞的活性均明显增强，抑制IL-17治疗后，破骨细胞的数量减少且骨破坏减轻[17-18]。这些研究说明，Th17细胞及IL-17在促进炎症和骨破坏方面发挥着重要作用。

DAS28评分是临床上观察RA患者病情的活动指标，能有效客观的评价患者的病情程度；目前临床上常常作为RA患者疾病活动度和经药物治疗后是否有效的评估指标。本研究结果显示，SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28在各组中差异均有统计学意义；另外，肖盼盼等[19]、崔潞萍等[20]报道SJC、TJC、VAS、ESR水平的升高与RA的病情活动指标呈DAS28评分正相关，提示DAS28评分在临床上可作为RA患者疗效观察及评价和预后判断的临床常用病情监测指标。我们依据DAS28-ESR评分将RA患者进行分组，比较四组间与健康对照组外周血中Th17细胞数量和血清IL-17的表达水平。本研究结果显示，RA患者各组与健康对照组相比，RA患者外周血中Th17细胞数量和血清IL-17表达水平均有明显升高，同时两两组间相比较其表达水平随疾病活动度的轻重逐渐升高且差异均有显著统计学意义，提示Th17细胞及IL-17两者均参与了RA的炎性发病过程，这与肖盼盼等[19]、车昌燕等[21]、张力力等[22]报道的研究结果相一致。RA患者各组与DAS28评分进一步Pearson相关性分析显示，RA患者各组外周血中Th17细胞数量和血清IL-17表达水平与DAS28评分均呈正相关性，这与曹艳玲等[23]报道的研究结果相一致，提示Th17细胞及IL-17参与了RA的炎症反应，且两者的表达率越高，RA患者的疾病活动度越重。

综上所述，Th17细胞及其效应因子IL-17具有很强的致炎和骨破坏作用，目前大量研究已经证实Th17细胞及其效应因子IL-17参与多种自身免疫性炎性疾病的发生及病情的进展。通过本研究我们可以进一步证实：Th17细胞及其效应因子IL-17在RA发病炎症反应过程中发挥重要作用，并且两者与DAS28评分之间存在明显的正相关性关系，临床上联合检测两者也有助于评估RA患者的疾病活动度。因此，我们可以推测：针对Th17细胞及IL-17的靶向生物制剂的研发，可以有效地减轻RA患者关节炎症反应及疾病活动度，为RA的治疗领域提供新的研究方向并具有广阔的应用前景[24]。

(图1—8见封三)