黄芪注射液干预糖尿病肾病大鼠后肾脏足细胞的变化

赵安菊 王智黔 黄平

(贵州省人民医院，贵州 贵阳 550002)

糖尿病肾病是糖尿病的常见及严重并发症之一，后期以大量蛋白尿及高度水肿为主，最终进展到终末期肾衰而致死亡，严重威胁人类健康。糖尿病是一种典型足细胞病，研究表明，足细胞损伤是 DN 进展的关键，足细胞损伤导致大量蛋白尿[1]。光镜下肾小球病变轻微，或轻度系膜增生；电镜下足细胞足突广泛融合，足细胞退行性病变[2]。研究发现[3]黄芪注射液有降低尿蛋白作用，肾脏足细胞减少或缺失是导致大量尿蛋白原因之一。本研究通过STZ腹腔注射法诱导建立糖尿病肾病SpragueDawley大鼠模型，并用黄芪注谢液进行治疗，在电镜下观察正常大鼠、糖尿病肾病(DN)大鼠及黄芪注射液治疗的DN大鼠肾脏足细胞超微结构形态变化，为黄芪注射液减少DN蛋白尿及改善肾功能提供客观依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 8周龄雄性SD大鼠24只，体质量150～200 g，购自第三军医大学动物中心。PHILIPS TECNAI-10透射电子显微镜(由第三军医大学生物测试分析中心提供)。

1.1.2主要试剂 STZ(美国Sigma公司);MAXVISION试剂盒(福建迈新公司)。2.5%戊二醛[0.1 mol/L(pH7.4)二甲砷酸钠缓冲液配制]、1%锇酸、30%、50%、70%乙醇溶液、80%、90%、95%、100%丙酮溶液、环氧树脂包埋剂、柠檬酸铅染液、双蒸水、超薄切片机、恒温箱、400目铜网等。

1.2实验方法

1.2.1动物造模及分组 24只雄性SD大鼠随机分为糖尿病肾病组(DN 组)、黄芪注射液干预组(H组)及对照组(C 组)，DN组及H组采用STZ 60 mg/ kg一次性腹腔注射，C组予等量柠檬酸缓冲液。以连续3次血糖> 16.6 mmol/ L，尿量> 原尿量150 %，尿蛋白排泄> 30 mg/ 24 h 尿者为成模标准。成模后H组给予黄芪注射液腹腔注射5 mg/kg/d 10 d后，留取24 h 尿液并股静脉取血，检测血糖、24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐处死大鼠。血糖检测采用酶电解层析法，尿蛋白定量检测使用双缩脲比色法，血尿素氮测定用GLDH 动力学法，血肌酐浓度测定用酶法。经腹主动脉灌注生理盐水后摘取右肾。

1.2.2电镜标本制作 取各组大鼠的肾脏组织，立即投入固定液中，取材要迅速，以防止细胞缺氧发生超微结构变化。把样本立即投入到0.1 mol/L(pH7.4)的二甲砷酸钠缓冲液配制的2.5%戊二醛中，4 ℃固定2 h。然后用0.1 mol/L(pH7.4)的二甲砷酸钠缓冲液洗三次，再放入用相同缓冲液配制的1%锇酸中固定2 h(4 ℃)。用双蒸水清洗固定好的标本，按顺序投入到30%、50%、70%的乙醇中，在4 ℃条件下各10 min．然后再投入到80%、90%、95%的丙酮中各10 min，100%的丙酮中两次，每次10 min脱水。把标本由100%丙酮中移入装有混匀包埋剂的小瓶中，在30 ℃下震荡4h浸透。把标本放入胶囊底部，将混匀的包埋剂分装入胶囊中进行包埋，加好标签，把装有标本和包埋剂的胶囊置35 ℃、45 ℃、60 ℃温箱中各24 h，使包埋剂聚合，硬化，由流体变为均匀的固体。然后切厚度为1 μm、2 μm 超薄切片，将切片样本置入枸缘酸铅染液中染色，1%NaOH溶液洗一次，水洗二次，干燥后送样，上机观察拍照。

2 结 果

2.1生化指标 DN组血糖及尿蛋白量(24 h)较C 组及H组显著增高(P<0.05)，见表1。

表1 三组血糖、肾功能及尿蛋白量(24 h)的变化

注：与C组比较，△P< 0.05，与DN组比较，*P< 0.05.

2.2各组电镜下表现 电镜下可见C组大鼠肾小球毛细血管袢结构清晰，肾小球囊腔结构清晰，足细胞足突紧贴于毛细血管基膜外，突起之间可见裂孔，足细胞排列整齐，结构正常，肾小球基底膜及系膜基质结构正常，基底膜未见增厚。DN组大鼠肾组织可见肾小球毛细血管袢正常屏障结构紊乱模糊、丧失，小球毛细血管基底膜弥漫性增厚，肾小球囊腔消失；足细胞结构萎缩，足细胞数目减少，足突广泛融合，足突裂孔消失，系膜外基质(ECM)增多，肾脏病理超微结构明显改变。H组大鼠肾组织基底膜、足突融合等病理改变均较DN组有所减轻。

注： A：正常对照组；B：糖尿病肾病模型组；C：黄芪注射液干预组。

图1各组电镜下表现

3 讨 论

糖尿病是一种常见病、多发病，严重危害人类健康，糖尿病肾病是其常见及严重并发症之一，已成为导致终末期肾病的主要原因[4]。足细胞(podocyte)是贴附于肾小球基底膜(GBM)外侧面的脏层上皮细胞，电镜下可见自胞体伸出许多突起，其足突间的滤过裂孔是构成肾小球滤过屏障的结构之一。糖尿病状态下高糖、非酶糖基化蛋白均可引起足细胞数量减少和密度降低，而糖尿病白蛋白尿的产生主要是由于肾小球足细胞减少及结构受损，致使肾小球滤过屏障破坏所致[5]。足细胞是结构复杂的肾小球终末分化细胞，为最容易损伤的部分，其增殖能力有限，若被损伤，则会导致蛋白尿的产生，同时足细胞也被认为是一种高度分化、分裂增殖能力有限的终末细胞，一旦损伤或缺失就很难再生[6]。

黄芪为补气要药，临床上较多研究发现黄芪制剂具有减少肾病患者尿蛋白、降低血糖、改善肾脏血流等作用，从而改善肾功能[7-8]。但其改善肾功能及减少尿蛋白的机制仍不十分清楚。有研究[9]发现高糖能抑制体外培养的足细胞活力，减少足细胞的数目，而黄芪甲苷能显著对抗高糖环境对足细胞的不良影响。因此，黄芪可能是通过减轻足细胞损伤而发挥保肾作用。本研究通过电镜下观察正常大鼠、STZ诱导的糖尿病肾病大鼠及黄芪干预后的糖尿病肾病大鼠的肾小球足细胞超微结构变化差异，为进一步探讨黄芪注射液降低糖尿病肾病尿蛋白机制提供客观依据。

本研究通过建立STZ诱导的糖尿病肾病(SD)大鼠模型，并给与黄芪注射液干预10 d，结果显示：生化指标DN组较C组肾功明显异常，24 h尿蛋白明显增加，H组肾功能及24 h尿蛋白较DN组明显改善(P<0.05)，但未能恢复正常，提示黄芪注射液可一定程度减少糖尿病肾病大鼠蛋白尿，进而改善肾功能。进一步电镜下观察正常大鼠、DN大鼠及黄芪注射液干预后大鼠肾小球足细胞超微结构，发现DN组较正常组肾小球足细胞数目明显减少，足突广泛融合，足突裂孔减少，肾小球毛细血管基底膜正常屏障结构丧失，黄芪注射液干预组大鼠肾脏肾小球足细胞病变较糖尿病肾病组大鼠有所减轻。通过以上生化指标及电镜下足细胞超微结构变化客观提示黄芪注射液可能通过改善肾小球足细胞损伤进一步减少尿蛋白，从而改善肾功能。该研究不足之处在于药物使用时间较短，没有设置药物分组及成熟的阳性对照组，在今后的后续研究中进一步改进。