锌指蛋白ZNF139抑制骨肉瘤细胞增殖和转移的机制研究

谢易 李彬彬 龚泰芳

(湖北医药学院附属太和医院骨科，湖北 十堰 442000)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)的特征是恶性细胞直接形成未成熟的骨或类骨组织，被认为起源于间充质干细胞，常见于儿童和成人[1]。根据美国国家癌症研究所的最新估计，在所有新癌症病例中，OS占0.2%(3260)，在2018年，OS占癌症死亡的0.3%(1550)[2]。磁共振、新辅助化疗、外科手术等是OS诊断和治疗的主要方法，但由于侵袭性和远处转移(主要是肺转移)，总生存率仍然很低，治疗OS需要新的有效可靠的方法和靶点。因此，阐明骨肉瘤的分子机制对于开发新的治疗策略以改善患者的预后至关重要。寻找早期诊断和评估骨肉瘤预后的分子靶点具有重要意义。ZNF139基因是目前发现的肿瘤抑癌基因，在胃癌的侵袭转移、肿瘤耐药性等机制中发挥着重要的作用[3-6]，但在骨肉瘤中的研究尚不清楚。本研究通过验证ZNF139在人骨肉瘤组织和细胞系中的表达，以及ZNF139基因对人骨肉瘤细胞增殖和转移的作用及机制，以期揭示其对骨肉瘤发生发展的相关分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 细胞：骨肉瘤细胞系(143B、MG-63、U2OS和HOS)以及正常人成骨细胞hFOB1.19 购自上海生科所生物细胞库；试剂：1640 培养液和胎牛血清购自美国 Gibico 公司、CCK-8 试剂购自日本同仁化学公司、酶联蛋白V(AnnexinV)/碘化丙啶(PI)染色试剂盒购自上海碧云天公司、六孔板、96孔板购自上海威奥生物科技有限公司、实验用一抗购自美国 CST 公司、实验用二抗购自美国 CST 公司、PVDF膜购自美国 Millipore 公司、Cocktail 试剂购自美国罗氏试剂公司。

1.2仪器和临床组织样本 实验中所用的仪器(细胞培养孵育箱、RNA浓度测量仪器Landdrop、qPCR仪、酶标仪等)均由湖北医药学院中心实验室提供和使用。Tranwsell小室和基质胶(美国Millipo)。ZNF139 基因引物由天津金唯智有限公司设计并合成；收集我科2010年1月至2017年1月治疗的29例骨肉瘤患者的肿瘤样本，以邻近正常组织样本和病理资料。本研究得到了我院的伦理委员会的批准，组织标本诊断由我院病理科高年资医师诊断。

1.3实验方法

1.3.1细胞和组织RNA和蛋白提取 骨肉瘤细胞和成骨细胞的RNA和蛋白以及上述临床样本中RNA和蛋白提取步骤同已有的文献报道[7]。提取后RNA在Landdrop仪器中测得浓度，通过RNA逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，实验方法及步骤参考样品实验说明书及已有的参考文献[13]。将逆转录后的cDNA放于-20 ℃冰箱中保存。

1.3.2qRT-PCR检测ZNF139在骨肉瘤中的表达 qRT-PCR 的步骤同试剂盒使用说明书和文献所述[15]。ZNF139-F：5’-GACTGGAAGAAGCTGCTGCTAA-3’，ZNF139-R：5’-CTGACGTCTCCACAGCACTCACT-3’。使用 HT7500 生物系统以及 SYBR®Green的试剂盒。通过实时监测 PCR 扩增，选择β-actin为内参基因，每个样品做三个重复；用2-△△Ct法对样本基因进行表达差异相对定量分析，在扩增的指数期对起始模板进行定量，扩增指数越高，相对表达越高。

1.3.3qRT-PCR检测ZNF139在骨肉瘤中的表达 ZNF139过表达质粒载体购买于天津金唯智生物科技有限公司。质粒转染方法和步骤同参考文献[8]，活性状态下的骨肉瘤细胞143B种于在六孔板中，转染载体：Lipofectamine-2000(美国通用应力公司)，细胞转染48h后收集实验组和对照组细胞进行相应的功能实验。

1.3.4CCK-8法和克隆形成实验检测ZNF139基因过表达对肿瘤细胞增殖活性的影响 CCK-8法：上述质粒转染143B细胞48 h后取实验组和对照组细胞计数，3 000 细胞/100 μL 1 640 培养液细胞加入96孔板中放于细胞孵育箱中继续培养约24 h；待细胞完全贴壁后，每孔加入20 μL的CCK8试剂继续培养2～3 h，使用酶标仪(480 nm)测定实验组和对照组的吸光度，然后统计作图。克隆形成实验：细胞转染 48 h后，实验组与对照组计数，取1 000个细胞/100 μL 1 640培养液的细胞加入六孔板中，将六孔板放于37 ℃，5% CO2的孵育箱中继续培养二周，当细胞形成集落克隆团后，多聚甲醛固定、染色并计数，然后统计作图。

1.3.5流式细胞周期和凋亡实验 流式细胞周期的方法同参考文献[9]。质粒转染143B细胞48 h后取实验组和对照组细胞计数，收集并使用多聚甲醛4 ℃进行固定约24 h，避光下使用PI染色，并送流式细胞仪进行分析和统计作图。细胞凋亡：细胞转染48 h后收集细胞，Binding 缓冲液重悬，分别加入V-fluorescein 和碘化丙锭(PI)混匀，避光30 min，送流式细胞仪分析，统计作图。

1.3.6Transwell实验检测迁移和侵袭的影响 Transwell 迁移实验：收集上述实验组和对照组骨肉瘤143B细胞，消化离心后并重悬；倒置显微镜下计数，取4×103个细胞/孔种于 transell小室上室，下室加入10% 1 640培养液约700 μL，放入细胞孵育箱中继续培养；待24 h后取出小室，固定，染色，计数(显微镜下随机5个视野)；计数并评价细胞迁移能力。Transwell 侵袭实验：实验前在transwell小室上室中加入基质胶(无血清1 640培养液：基质胶=1∶5)混匀，基质胶小室放入细胞孵育箱中约2～4 h，待基质胶凝固后进行侵袭实验; 侵袭实验步骤基本同细胞迁移实验。所有实验均重复3次。

1.3.7免疫蛋白印迹实验 蛋白质印迹法检测143B在细胞系中的相对表达：收集实验组和对照组，提取细胞蛋白后测定蛋白浓度[10]。取50 μg/孔细胞蛋白进行凝胶电泳，常温下将电泳分离后的蛋白转膜于PVDF膜上，5%脱脂牛奶的TBST室温下封闭2 h，加入一抗及内参GAPDH(美国Abcam公司)，4 ℃冻库封闭过夜。24 h后常温下复温约30 min，TBST液洗膜后，二抗封闭液室温下摇床孵育2 h，显色剂(DAB)显色、成像仪曝光，并用 Quantity One 软件分析蛋白灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH之比来表示相对表达差异。

2 结 果

2.1ZNF139 在骨肉瘤细胞系和组织中的表达 半定量PCR实验发现，与正常成骨细胞相比，ZNF139 mRNA蛋白在骨肉瘤细胞系143B、MG-63、U2OS和HOS中低表达，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图1A；同时qRT-PCR实验显示，在配对的肿瘤组织中，与癌旁组织相比，ZNF139 mRNA的水平在骨肉瘤中表达下调，差异有统计学意义(P<0.001)，见图1B。免疫蛋白印迹实验发现：与正常成骨组织比，ZNF139 蛋白在骨肉瘤组织中表达下调(P<0.001)，见图1C。

注：(A)ZNF139 mRNA在骨肉瘤细胞系中低表达，***P<0.001;(B)ZNF139 mRNA在骨肉瘤组织中低表达，***P<0.001;(C)ZNF139 蛋白在骨肉瘤组织中表达下调，P<0.001。

图1ZNF139在骨肉瘤细胞系和组织中的表达

2.2过表达 ZNF139 基因对抑制肿瘤细胞增殖的影响 为验证ZNF139是否为功能性抑癌基因参与骨肉瘤进展，我们对骨肉瘤143B进行ZNF139的过表达，免疫蛋白印迹实验验证了ZNF139的过表达(图2A)。CCK-8实验发现，实验组143B细胞转染ZNF139后，24h、48h和72h后细胞存活率显著下降(P<0.01)，见图2B；克隆形成实验发现，实验组143B细胞克隆形成的效率(31.23%±4.18%)下降(P<0.001)，见图2C。

注：(A)免疫蛋白印迹实验验证ZNF139在143B中的过表达；(B)CCK-8实验ZNF139抑制细胞活性，P<0.01；(C)平板克隆显示ZNF139 在抑制细胞克隆的形成，***P<0.001。

图2ZNF139过表达对抑制骨肉瘤细胞143B增殖的影响

2.3恢复表达ZNF139基因对细胞周期及凋亡的影响 流式细胞实验发现：骨肉瘤细胞143B过表达ZNF139后，细胞出现G0/G1期阻滞；与对照组(28.18%±3.12%)相比，实验组中G1期细胞百分比明显增加(45.68%±4.92%)，差异具有统计学意义(P<0.001)，见图3A；同时凋亡实验发现，骨肉瘤细胞143B过表达ZNF139后，细胞明显发生凋亡，凋亡细胞增加(14.29%±5.14%)，差异具有统计学意义(P<0.001)，见图3B。

注：(A)ZNF139过表达后使143B细胞阻滞于G1期，***P<0.001；(B) ZNF139过表达后促进143B细胞凋亡，***P<0.001。

图3过表达ZNF139对细胞周期阻滞和促进凋亡的影响

2.4过表达ZNF139 基因对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响 Transwell细胞迁移和侵袭实验分别检测稳定过表达 ZNF139 以及转染 pcDNA3.1(+)的143B细胞的迁移能力；结果发现：稳定转染了pcDNA3.1(+)-ZNF139 实验组穿过小室细胞数显著低于对照组 pcDNA3.1(+)-Vector 组，差异具有统计学意义(P<0.001)，见图4。

注：与对照组比较，***P<0.001。

图4ZNF139过表达对骨肉瘤143B细胞迁移和侵袭的影响

2.5过表达ZNF139对p53信号通路的影响 通过蛋白质印迹检测过表达ZNF139后对p53及下游靶基因的影响，结果显示：过表达ZNF139后，p53激活上调及下游周期相关靶基因p21和p27的表达上调(P<0.001)，见图5A、5B；同时凋亡相关蛋白BAX和Claeaved-Casp3表达上调(P<0.001)，见图5A、5B。

注：(A)Western blotting 分析过表达ZNF139对p53信号通路的影响；(B)蛋白灰度分析ZNF139对p53信号通路相关靶点的影响，两组比较，***P<0.001。

图5ZNF139 过表达后对p53信号通路的影响

3 讨 论

骨肉瘤是原发性骨恶性肿瘤死亡的主要原因，主要发生在青少年和儿童。根据癌症统计，骨和关节恶性肿瘤占青少年和儿童癌症死亡总数的8.9%[15]。文献报告中：骨肉瘤手术切除患者的长期生存率仅为20%[16]。目前，以顺铂为基础的联合化疗大大改善了骨肉瘤患者的预后，5年无转移总生存率为60～70%[17]。然而，化疗耐药性仍是困扰骨肉瘤临床治疗的主要问题。近几十年来，越来越多的研究开始致力于骨肉瘤的靶向治疗；希望通过寻找到有效的治疗靶点用于骨肉瘤的早期诊断与治疗。锌指蛋白(ZFPs)是脊椎动物基因组家族中最大的转录因子；大约三分之一的ZFP包含了与Krüppel相关的KRAB结构，超过一半ZFPS聚集在染色体19q13区域。ZFPs在调节细胞增殖、凋亡、分化和肿瘤发生中起重要作用。而ZFPs在骨肉瘤中作用的报道非常少见。ZNF139的cDNA为6.4 kb，编码360个氨基酸；这种蛋白质在从大鼠到人的不同脊椎动物物种的进化过程中高度保守；已有文献报道其在组织器官发育，肿瘤形成中起着重要的作用，但在骨肉瘤中的作用尚不清楚。

本研究中我们首先检测了ZNF139 在骨肉瘤细胞系和组织中的相对表达情况。研究发现，与成骨细胞相比，ZNF139 mRNA在骨肉瘤细胞系中表达下调；在配对的临床样本组织中，ZNF139 mRNA和蛋白在骨肉瘤组织中表达明显下调，其可能作为潜在的抑癌基因参与骨肉瘤的进展。本研究结果显示，ZNF139能够通过诱导细胞周期抑制和促进凋亡来抑制细胞的增殖；通过transwell实验发现转染pcDNA3.1(+)-Flag-ZNF139质粒后实验组细胞的迁移和侵袭能力明显下调；因此进一步提示ZNF139作为功能性抑癌基因参与骨肉瘤的生物学进程。

p53在调控细胞周期和DNA损伤修复中起着关键作用，并且抑制正常细胞发展为恶性表型[18]。此外，肿瘤抑制蛋白p53是凋亡途径的重要组成部分，BCL2和BAX都是p53的重要转录靶基因；BCL2和BAX能影响线粒体细胞膜凋亡方式[19]。在本研究中，ZNF139增加了p53的转录和p53下游靶基因如：p21、p27和BAX等的表达；进一步提示ZNF139通过激活p53信号通过参与骨肉瘤的发生发展。

综上，本研究显示ZNF139基因在骨肉瘤组织中表达下调，过表达ZNF139后能通过激活p53信号通路来调控骨肉瘤的进展。但ZNF139在组织和细胞系表达与临床预后，以及体内实验中是否作为抑癌基因参与肿瘤进展尚需要进一步的研究。