艽龙胶囊及其主成分对功能性消化不良大鼠的治疗作用

郭伦锋 刘铁明 袁鹰 董明芝 谢艳华 王四旺

(1.安康市中心医院药剂科，陕西 安康 725000；2.西安正大制药有限公司，陕西 西安 710043；3.西北大学生命科学与医学部，陕西 西安 710069)

胃和十二指肠功能紊乱可导致一系列消化道病症[1]，称为功能性消化不良(functinal dyspepsia，FD)。其主要病理机制是胃肠动力障碍，常合并抑郁、焦虑、情绪异常等精神心理性障碍[2]。据胡柳丹等[3]报道，普通人群中约20%～40%伴发不同程度的FD。我国部分地区的FD患者在消化内科门诊就诊患者中的比例高达50%[4]。秦艽是我国重要的传统中药材，其主要功效为祛风湿、清湿热、止痹痛和退虚热[5]。艽龙胶囊由秦艽的提取物制成，具有清肝泄热的功效，用于功能性消化不良。现代临床及实验研究均表明，艽龙胶囊对FD具有良好疗效，能明显缓解患者的症状，提高胃肠消化能力[6]。本课题组前期研究发现，10批艽龙胶囊中含龙胆苦苷(约占百分比)、马钱苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、山栀苷甲酯、獐芽菜苷、异荭草苷、异牡荆黄素的含量依次为483.760(65.0%)、104.337(15.0%)、49.291(6.5%)、8.304(1.1%)、7.170(1.0%)、5.124(0.7%)、0.885(0.1%)、0.608(<0.1%)mg/g；其中6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、马钱苷酸和獐芽菜苦苷转移率依次为87.23%～97.88%、81.47%～96.15%、48.90%～86.47%和21.34%～44.67%%[7]。有研究表明，中药促进胃动力的作用机制可能与抑制FD大鼠胃窦组织细胞的自噬相关[8]；内质网应激可通过蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/磷酸化真核翻译起始因子2α(eIF2α)信号通路调控自噬[9]；本研究旨在探讨艽龙胶囊及其主要成分对FD大鼠治疗作用，明确其治疗FD的功效成分和作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 SPF级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠80只，6～8周龄，体质量180±20 g，购自空军军医大学实验动物中心，许可证号为SCXK(军)2012-0007。动物在独立换气笼盒(IVC系统)饲养，温度22～26 ℃，湿度50%～70%，12 h光照/黑暗周期循环，适应性饲养一周后用于实验。

1.1.2药物 艽龙胶囊(批号20170216K)由西安正大制药有限公司提供；龙胆苦苷(纯度98%，批号201703112)、马钱苷酸(纯度98%，批号201701201)、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷(纯度98%，批号201802093)、山栀苷甲酯(纯度97%，批号201802103)均购于上海纯优生物科技有限公司；多潘立酮片(批号180511230，国药准字H10910003)，购自西安杨森制药公司。

1.1.3试剂与仪器 PERK单克隆抗体，美国Novus公司；p-eIF2α单克隆抗体，美国CST公司；血清胃促生长素(Ghrelin，GH)和血管活性肠肽(VIP)酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒，购自上海谷研实业有限公司。Modle型酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)，Milli-Q Academic 超纯水系统(Merck Millipore 集团公司)，生物显微镜和图像分析系统(美国Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1造模及给药 采用随机数字法将大鼠随机分为8组，每组10只，除空白组外，其余组大鼠参照张钰琴等方法[10]造模。即每日用包裹海绵的长钳夹大鼠尾部末端1/3处，以不破皮为度，令其尖叫或与其他大鼠打斗，30 min/次，2次/d，每2次间隔至少8 h，持续4周。期间如有大鼠被抓伤，可用0.5%碘伏消毒受伤部位，以防感染。于造模第1天开始各组灌胃相应药物进行治疗，正常和模型组动物灌胃等容量蒸馏水，1次/d，共4周。

1.2.2胃排空率和肠推进率检测 参照黄爱华[11]方法，大鼠末次给药后禁食不禁水24 h，按15 mL/kg 体质量灌胃营养半固体糊(组成：羧甲基纤维素钠10 g、全脂奶粉16 g、糖8 g、淀粉8 g、蒸馏水200 mL、1 mL碳素墨水)，30 min后，10%水合氯醛麻醉，背卧位固定于鼠板上，腹主动脉采血。结扎贲门和幽门，取完整胃，滤纸吸干称取量全胃重量，沿胃大弯剪开胃壁并用生理盐水冲洗干净胃壁，滤纸吸干，称取重量为空胃重。取出小肠在白纸上摆直，检测小肠的总长度L(自幽门到回盲部距离)和碳末推进的距离L0(自幽门到碳末推进的前端距离)，按照如下公式计算胃排空率和肠推进率。胃排空率(%)=[1-(全胃重-空胃重)/总灌胃量]× 100%；肠推进率(%)=L0 /L×100%。

1.2.3血清中GH及VIP检测 血样在室温静置3 h，3 000 r/min离心15 min，分离上层血清。按照ELISA试剂盒中检测步骤对血清中GH和VIP含量进行检测。将标准品及血清样品加入96孔板中，与一抗共同孵育1.5 h，倒出板内液体，洗板5次，加入二抗继续孵育30 min，孵育结束洗板3次，加入显色剂15 min后加反应终止液，酶标仪测吸光度，计算得出GH和VIP含量。

1.2.4胃窦组织中PERK、p-eIF2α蛋白检测 取出冻存于-80 ℃冰箱的胃窦组织，称量1.0 g，眼科剪剪碎成细末状，加入十倍体积的组织裂解液，按比例加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，置冰上反复研磨，提取组织中总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量后，加入上样缓冲液，置沸水中煮5 min，冻存于-80 ℃冰箱，Western blot(WB)检测PERK、p-eIF2α蛋白含量。配胶试剂盒配置分离胶和浓缩胶，待充分凝固后，加入提取的蛋白样品，初始恒压80V电泳30 min，待marker分开即转为120 V恒压至电泳结束。200 mA恒流湿转2.5 h，将蛋白转移至0.45 μm的PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1.5 h，洗膜，一抗4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜，室温孵育二抗2 h，洗膜后化学成像发光仪进行显影，分析软件计算灰度值，并做统计学分析。

1.3统计学方法 采用SPSS23.0软件分析数据，所有数据用(meanSD)方式表示，检验前对数据进行正态检验和方差齐性检验，若服从正态分布且方差齐性，则用参数检验中的One-way ANOVA分析，若方差不齐，则采用非参数检验中的独立样本分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1各试药对大鼠胃排空率和肠推进率的影响 与正常组比较，模型组大鼠胃排空率和肠推进率降低(P<0.01)；与模型组比较，艽龙胶囊、龙胆苦苷和山栀苷甲酯组大鼠胃排空率有统计学差异(P<0.05)，艽龙胶囊和龙胆苦苷组大鼠肠推进率与模型组相比有统计学意义(P<0.01)，山栀苷甲酯组改善作用虽不及艽龙胶囊组，但仍具有统计学差异(P<0.05)，而马钱苷酸及6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷组对胃排空率和肠推进率无影响，见表1。

表1 各组的胃排空率和肠推进率

注：与正常组比较，△P<0.01；与模型组比，*P<0.05，#P<0.01。

2.2各试药对血清中GH和VIP水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清中GH含量降低，而VIP含量升高(P<0.01)；与模型组比较，艽龙胶囊和龙胆苦苷能升高血清中GH水平同时降低VIP含量(P<0.01)，山栀苷甲酯也能一定程度的升高GH和降低VIP含量(P<0.05)。此外，与模型组比较，马钱苷酸及6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷虽对血清中GH含量无影响，但能降低血清中VIP的含量(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清中GH和VIP含量

注：与正常组比较，△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.3各试药对胃窦组织中PERK、p-eIF2α蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组胃窦组织中PERK和p-eIF2α蛋白表达升高(P<0.01)；与模型组相比，艽龙胶囊及其主要成分龙胆苦苷和马钱苷酸能够降低胃窦组织中PERK蛋白表达，具有统计学差异(P<0.01)，而6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷和山栀苷甲酯对PERK蛋白表达无显著影响(P>0.05)；与模型组相比，艽龙胶囊及其主要成分龙胆苦苷能降低p-eIF2α蛋白表达(P<0.01)，山栀苷甲酯组的p-eIF2α蛋白含量与模型组差异具有统计学意义(P<0.05)，而马钱苷酸及6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷对p-eIF2α蛋白表达无显著影响(P>0.05)。见图1。

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图1各组大鼠胃窦组织中PERK和p-eIF2α蛋白含量

3 讨 论

FD在我国的发病率逐年上升，现代研究认为FD发病多与胃肠功能障碍、神经系统及神经递质调节有关[12]。胃肠激素是影响胃肠动力的重要因素，其中GH作为一种生长激素促分泌素受体的配体蛋白，主要分布于胃肠道，作为垂体—下丘脑—胃肠道的媒介，参与机体的能量代谢、胃肠消化蠕动和内分泌等过程，具有促进摄食的作用[13]。VIP蛋白是一种舒血管肠肽，能够调节平滑肌和腺体分泌，从而抑制性调节胃肠动力，在消化系统、呼吸系统等多个组织均有分布[14]。

Daidoo等[15]证实，内质网是感应微妙环境变化、细胞压力、协调信号通路、调控细胞功能及细胞存活的重要细胞器。所以，机体蛋白过度突变、病毒感染、能量营养缺乏等均可损伤内质网蛋白折叠功能，导致内质网腔内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的大量聚集，产生内质网应激；PERK/eIF2α信号通路是内质网应激状态下最先激活的一条重要通路。有研究表明，内质网应激持续时间过长或者过度时，PERK/eIF2α信号通路则无法恢复内质网的功能，促使细胞走向自噬[16]。由此可见PERK的激活和p-eIF2α是内质网应激存在的重要标志物。

我们研究结果发现，FD大鼠血清中GH含量远远低于正常组，血清中VIP含量和胃窦组织内PERK和p-eIF2α蛋白表达均显著升高，说明FD大鼠模型成功建立。艽龙胶囊及其主成分即龙胆苦苷和和山栀苷甲酯干预后，FD大鼠血清中GH含量升高，VIP含量及胃窦组织内PERK和p-eIF2α表达均显著降低，表明艽龙胶囊治疗FD的功效与其显著促进FD大鼠胃排空和肠推进的作用，促进GH分泌，抑制VIP水平，同时抑制内质网应激信号通路PERK/eIF2α有关。

艽龙胶囊是临床证实对治疗FD具有显著疗效的中药制剂，其主要成分是秦艽提取物，经本课题组前期研究证实，大鼠给予一定剂量的艽龙胶囊后，在血浆及重要脏器组织中可以检测到龙胆苦苷、马钱苷酸、山栀苷甲酯、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷和獐牙菜苷等成分，且在60 min时即可达到较高的浓度，其中胃肠道中各有效成分的含量均较高。本研究结果显示，艽龙胶囊及其主成分龙胆苦苷和山栀苷甲酯在促进FD大鼠的胃排空率、肠推进率和升高血清中GH水平，降低血清VIP和胃窦组织中PERK蛋白及p-eIF2α蛋白表达水平方面，均表现出与艽龙胶囊和多潘立酮非常一致的作用，由此说明，龙胆苦苷和山栀苷甲酯是艽龙胶囊治疗FD的主要功效成分。