miR-200c靶向程序性死亡蛋白配体1基因抑制结肠癌细胞的侵袭能力

孔晓静

(山东省东明县中医医院内科,山东 东明 274500)

近年来我国结肠癌发病率及病死率呈上升趋势〔1,2〕，肿瘤逃避机体免疫监视是肿瘤发生发展的重要机制，程序性细胞死亡蛋白 (PD)-1与配体(PD-L1)结合后使T细胞受体信号通路多个关键的信号分子去磷酸化，从而抑制免疫应答〔3,4〕，PD-1/PD-L1 抗体药物纳武单抗是目前消化系统肿瘤免疫治疗领域的热点，已有研究报道miRNA 作为表观遗传调控的重要成员，通过调控 PD-1/PD-L1的表达抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭〔5,6〕，本研究通过免疫组织化学法检测PD-L1分子在结肠癌组织中的表达状况，并与临床病理特征进行相关性分析，初步探索 miR-200c靶向调控PD-L1基因对结肠癌细胞侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集山东省东明县中医医院2016年1月至2017年12月行结肠癌根治术47例患者的癌组织、癌旁组织(距肿瘤边缘大于5 cm)组织标本，47例患者中男32例，女15例，平均年龄(52.6±8.4)岁，升结肠癌17例，横结肠癌5例，降结肠癌13例、乙状结肠癌12例，患者均为初始治疗，术前未接受放化疗治疗，术后病理证实为结肠恶性肿瘤。结肠癌LoVo细胞购自中科院上海细胞库。

1.2主要试剂 10%胎牛血清、DMEM 培养液(美国Gibco公司)、 LipofectamineTM3000脂质体、miR-200c模拟物(上海生工生物工程有限公司合成)、侵袭小室(美国Sigma公司)、双荧光报告基因检测试剂盒(美国Promega公司)、鼠抗PD-L、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3免疫组化法检测结肠癌组织中PD-L1蛋白的表达 取47例结肠癌患者手术标本，常规、脱蜡水化、高温抗原修复、封闭，加入兔抗人PD-L1单克隆抗体、二抗孵育、DAB显色、苏木精复染、封片，结肠癌组织标本的免疫组化切片均由2名资深病理科医生独立双盲观察，细胞内出现棕黄色颗粒者为阳性。

1.4细胞培养与转染 将结肠癌LoVo细胞培养于添加10%胎牛血清的DMEM培基中，37℃、5%CO2的培养箱中孵育培养，通过TargetScan 靶基因预测库预测 miR-200c能与PD-L1 的3′-UTR 结合，取对数生长期结肠癌LoVo细胞，0.25%胰酶消化后将细胞分成3组，转染组转染 miR-200c mimic，阴性对照组转染 miR-NC，空白对照组为正常培养LoVo细胞。将上述3组细胞利用LipofectamineTM3000脂质体转染后，根据Trizol试剂盒说明书提取总RNA，按照Invitrogen试剂盒说明书进行反转录反应、扩增，以β-actin为内参，用Real-time PCR法检测细胞中miR-200c、PD-L1 mRNA的表达，miR-200c、PD-L1的引物序列见表1。

表1 β-actin、miR-200c、PD-L1的引物序列

1.5荧光素酶报告基因检测各组双荧光素酶活性 将含有miR-200c结合位点PD-L1的3′-UTR片段插入pGL-3荧光素酶报告基因载体，构建野生型和突变型的荧光素酶报告载体，分别将miR-200c、miR-NC和pGL-3荧光素酶报告载体共转染结肠癌LoVo细胞，共3组细胞：①miR-200c mimic+pGL-3 PD-L1 3′-UTR-Wt(转染组)；②miR-NC mimic+pGL-3 PD-L1 3′-UTR-Wt(阴性对照组)；③空白对照组细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h，按照Promega公司双荧光素酶检测方法进行检测。

1.6Transwell法检测细胞侵袭能力 将转染组转染 miR-200c mimic，阴性对照组转染 miR-NC，空白对照组为正常培养LoVo细胞进行转染48 h后，0.25%胰酶消化，接种到Transwell上室后加入DMEM培养基，下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养箱中培养48 h后，取出 Transwell小室，冲洗、固定、染色后，倒置显微镜下观察计数。

1.7统计方法 采用SPSS18.0统计软件进行t检验、方差分析，PD-L1与临床病理特征的相关性分析采用χ2检验。

2 结 果

2.1PD-L1在结肠癌组织中的表达及与临床病理特征的关系 PD-L1主要表达于肿瘤细胞和淋巴细胞(图1)，结肠癌组织中PD-L1蛋白表达阳性率为55.3%(26/47)，显著高于癌旁组织〔27.7%(13/47)〕，差异有统计学意义(χ2=7.406，P=0.006 5)。结肠癌组织中PD-L1蛋白表达与肿瘤分化(χ2=6.021，P=0.031 2)、pN分期(χ2=7.141，P=0.003 7)、T分期有关(χ2=8.073，P=0.044 5)，与患者年龄、性别、肿瘤最大径、肿瘤部位无明显相关性(表2)。

图1 PD-L1在结肠癌组织中的表达(DAB，×400)

表2 PD-L1表达与临床病理特征的相关性(n)

2.2miR-200c靶向调控结肠癌LoVo细胞PD-L1的表达 转染组转染 miR-200c mimic后，细胞内miR-200c的表达明显上升，miR-200c水平(2.23±0.52)较空白对照组(0.43±0.12)、阴性对照组(0.51±0.15)明显升高，差异有统计学意义(F=57.45，P<0.000 1)，表明miR-200c mimic在结肠癌LoVo细胞中高表达，已成功转染 miR-200c mimic。miR-200c mimic转染后，细胞内PD-L1的表达下降至(0.27±0.06)，与空白对照组(1.12±0.38)、阴性对照组(1.35±0.44)有统计学差异(F=19.14，P=0.000 2)。miR-200c mimic转染组荧光素酶活性(0.38±0.11)，明显低于空白对照组(1.01±0.09)、阴性对照组(1.05±0.10)，差异有统计学意义(F=118.2，P<0.000 1)。

2.3miR-200c对LoVo细胞侵袭能力的影响 miR-200c mimics 转染结肠癌 LoVo细胞48 h后，细胞迁移数目(156±43.6)明显低于空白对照组(239±59.8)、阴性对照组(274±61.9)，差异有统计学意义(F=7.102，P=0.006 8)。

3 讨 论

肿瘤免疫治疗通过活化特异性T淋巴细胞，激活和增强机体对肿瘤细胞的免疫应答，是最新而且有效的肿瘤治疗手段〔7，8〕。PD-1是表达于T细胞表面的负共刺激信号分子，活化的PD-1通过与配体PD-L1结合，募集蛋白酪氨酸磷酸酶，使T细胞受体信号关键分子去磷酸化，抑制抑制免疫应答〔3～5，9〕，多项研究证实PD-L1在胃癌、肝细胞癌等实体肿瘤中呈过表达状态〔10～12〕。我们的研究发现47例结肠癌组织中PD-L1蛋白表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、浸润深度有关，与患者年龄、性别、肿瘤直径大小、肿瘤部位无明显相关性，提示PD-L1可能与结肠癌的发生发展有关。

PD-L1是一种由290个氨基酸构成的跨膜蛋白，基因定位于染色体9p24，胞外区含有与PD-1结合的结构域〔13〕。miR-200c是miR-200 家族成员之一，与家族成员miR-141成簇定位于染色体12p13，miR-200 家族通过参与肿瘤转移的上皮-间质转化过程〔14，15〕，有研究证实miR-200b通过靶向PD-L1 3′-UTR抑制胃癌细胞内 PD-L1的表达〔16〕，提示miR-200 家族成员可能通过抑制PD-L1发挥其抑癌基因的作用。本研究通过脂质体使结肠癌LoVo细胞过表达miR-200c后，进一步证实miR-200c在结肠癌中靶向下调PD-L1，与肿瘤的发生发展、浸润转移有关，推测其原因可能与miR-200c下调PD-L1后，结肠癌肿瘤转移和免疫逃逸能力增强，提示miR-200c介导的PD-L1基因沉默可能与结肠癌的转移侵袭有关，然而其具体机制仍有待进一步研究。结肠癌是发病率较高的消化道恶性肿瘤，一项多中心结肠癌患者临床Ⅱ期试验证实，PD-1/PD-L1抑制剂Pembrolizumab对氟嘧啶或伊立替康治疗失败的结肠癌患者，具有较高的疾病控制率，可能是结肠癌患者免疫治疗的新方向〔17〕。免疫治疗在最新肿瘤治疗中崭露头角，免疫检测点PD-1及其配体PD-L1诱导免疫耐受是肿瘤免疫逃逸的关键分子，虽然目前PD-1/PD-L1抑制剂Nivolumab和Pembrolizumab在消化道肿瘤的治疗中应用广泛，但其机制仍有待于从细胞分子、基因水平进一步加以探索，本研究发现，PD-L1在结肠癌组织中高表达，且与肿瘤分化、淋巴结转移、浸润深度有关，miR-200c通过靶向结肠癌LoVo细胞内PD-L1 3′-UTR抑制PD-L1的表达，上调miR-200c表达可抑制结肠癌LoVo细胞侵袭能力。