水液相环境下羟自由基诱导的苯丙氨酸分子损伤机理

潘宇，庄严，姜春旭，刘薛涛，陶思宇，佟华*，王佐成*

（1.白城师范学院物理学院，吉林白城137000；2.白城师范学院计算机科学学院，吉林白城137000；3.白城师范学院传媒学院，吉林白城137000）

0 引言

苯丙氨酸(phenylalanine；Phe)是人体必需的氨基酸。按构型分为S-型苯丙氨酸(S-Phe)和R-型苯丙氨酸(R-Phe)，按光学活性可分为左旋体(L-Phe)和右旋体(D-Phe)。L-Phe在生命体内具有活性，是构成蛋白质的重要成分，对控制肿瘤转移有一定的作用，还可用作人类食品添加剂[1]。D-Phe是重要的化工和生物制药原料[2]。生命体内氨基酸的消旋及其结构的改变可导致生物衰老[3-4]。

基于Phe的作用及其手性转变可导致生命体衰老，人们对其结构、光谱和旋光异构进行了广泛研究。文献[5]研究了气相Phe的构象，结果表明，其可以有多个稳定构象，氨基与羧基间具有分子内单氢键并且氨基与苯环间的π-氢键构象最稳定。文献[6]通过实验测量了L-Phe的红外和紫外光谱，解释了Phe具有分子内氢键。文献[7]实验测量了L-Phe的转动谱，进一步证实了L-Phe具有分子内氢键。文献[8-10]对其旋光异构进行了较系统的研究。研究表明，气相Phe在通常情况下具有稳定性；水分子簇的催化可使微量Phe实现手性对映体转变；水分子簇催化和水溶剂助催化的共同作用可使少量Phe分子实现手性对映体转变，解释了生命体内有DPhe存在。

生命体是富水环境，糟糕的情绪、剧烈的运动和紫外线的照射等会使体内产生大量的羟自由基。羟自由基的氧化能力极强，可以通过抽氢和加成等反应对氨基酸造成损伤[11]。文献[12]研究表明，羟自由基抽取α-氢可导致气相α-丙氨酸损伤。文献[13-14]的研究表明，羟自由基抽取α-氢可导致水液相环境下的α-丙氨酸损伤。文献[15]的研究表明，羟自由基抽取α-氢可导致赖氨酸损伤。文献[16-17]的研究表明，羟自由基抽取α-氢可导致缬氨酸损伤，单臂碳纳米管（SWCNT）对其损伤反应具有助催化作用，而水溶剂效应对其具有阻碍作用。Phe分子的R基含有苯环、亚甲基和次甲基，羟自由基诱导Phe损伤的研究具有一定的挑战性，目前尚未见相关研究的报道。本工作对研究其他含有苯环的有机分子（数量极其庞大）的损伤也具有积极的意义。基于此，对水液相环境下羟自由基（水分子簇）诱导的Phe损伤进行了研究，期望在理论上对羟自由基（水分子簇）致Phe分子损伤给予解释，同时告诉人们应养成良好的生活与工作习惯，尽量降低体内的羟自由基含量。

1 研究与计算方法

采用能较好地处理氢键等弱作用的色散校正密度泛函的WB97X-D[18]方法，结合处理溶剂效应的自洽反应场理论的SMD模型[19]方法，在WB97XD/SMD/6-311++G(d,p)水平优化反应过程的驻点构象，对过渡态[20]进行IRC（内禀反应坐标）[21]计算，验证其确实连接所期望的局域极小点，在同一水平下对体系进行自然键轨道（NBO）分析，获得其原子自然电荷（NPA）。为获得更精确的反应过程的势能面，采用微扰理论的MP2[22]方法，在MP2/SMD/6-311++g(3df,2pd)水平计算驻点的单点能，用零点振动能校正与单点能之和作为总能量。本工作选取S-型Phe分子作为目标反应物，研究羟自由基诱导其损伤。S-Phe分子与羟自由基水分子簇形成的复合物，标记为S-Phe·[·OH)·H2O]，其他体系的标记相似。计算工作由Gaussian 09[23]程序在白城师范学院理论计算中心的服务器集群完成。

2 结果与讨论

水液相环境下S-Phe分子的最稳定构象[11]见图1。研究发现，羟自由基（水分子簇）抽取α-氢（α-碳3C上的氢）、β-氢（β-碳5C上的氢）、苯环-氢以及羟自由基与苯环加成均可致S-Phe分子损伤，下面分别进行讨论。

2.1 羟自由基（水分子簇）抽α-氢致S-Phe损伤

羟自由基（水分子簇）抽α-氢[NPA电荷计算表明，本文羟自由基（水分子簇）抽氢，均为抽“氢原子”，相似之处不再解释]，可分为羟自由基水分子簇与α-氢和氨基作用、羟自由基水分子簇与α-氢和羰基作用以及羟自由基与α-氢作用形成反应复合物，而后羟自由基抽氢的3种情况。对应的3个抽氢反应通道，分别命名为a、b、c，反应历程见图2，反应势能面剖面见图3，下面分别进行讨论。

图2 羟自由基（水分子簇）抽α-H导致S-Phe损伤的反应历程（键长：nm）Fig.2 S-Phe damage mechanism induced by α-H abstraction of hydroxyl radicals（water clusters）（bond length：nm）

2.1.1 a通道

在a通道，损伤的反应历程见图2(a)，反应势能面剖面见图3的a曲线。首先是反应物S-Phe的α-氢和氨基氢分别与羟自由基水分子簇的羟自由基和水分子作用，形成底物复合物a_S-Phe·[(·OH)·H2O]（α-氢的序号由4变为23了）。而后底物复合物a_S-Phe·[(·OH)·H2O]经·OH抽α-氢 23H的过渡态a_TS·[(·OH)·H2O]，异构成产物复合物 a_P*·(H2O)2。最后，产物复合物 a_P*·(H2O)2的a_P*和(H2O)2的分子间氢键解离，形成a_P*和二聚水(H2O)2。结构分析表明，a_P*·(H2O)2的1N—3C键长较短，小于a_S-Phe·[(·OH)·H2O]的1N—3C键长，1N、3C、5C、9O和21O形成了共轭的五中心大π键，水分子簇内以及水分子与氨基氢之间存在较强的氢键，水分子与α-碳以及水分子和羰基氧21O之间存在弱氢键，因此，a_P*·(H2O)2的构象稳定，处在很深的势阱中。a_P*是产物自由基，其α-碳上失去了氢原子，α-碳的手性已不存在，亦即a_P*失去了的手性，是损伤的Phe（后面相似之处不再解释）。

从a_S-Phe·[(·OH)·H2O]到a_TS·[(·OH)·H2O]过程，3C—23H键长从0.109 5 nm拉伸至0.123 0 nm断裂，反应活性中心骨架二面角1N—3C—4C—5C从125.29°变为129.32°，此过程化学键拉伸较小，活性中心骨架形变不明显，所需能量不高，3C—1N键长从0.146 0 nm收缩至0.143 7 nm，又会释放能量，过渡态的键角3C—23H—24O为176.67°，接近平角，3C—23H—24O具有较强的氢键，说明过渡态较稳定，因此 a_TS·[(·OH)·H2O]产生的内禀能垒非常低，只有6.7 kJ·mol-1。在此过程中，(·OH)·H2O中的H2O分子没有参与反应，其作用是稳定·OH的空间位置，使·OH处于抽取α-H原子的有利位置。从势能剖面可以看出，a_S-Phe·[(·OH)·H2O]不稳定，从反应物 S-Phe+[(·OH)·H2O]到反应复合物 a_S-Phe·[(·OH)·H2O]过程要吸热 61.7 kJ·mol-1。a_P*和(H2O)2之间的氢键解离能为81.6 kJ·mol-1，产物复合物 a_P*·(H2O)2可通过碰撞过程将其解离成a_P*和(H2O)2。

由于a_S-Phe·[(·OH)·H2O]不稳定，也可将该基元反应视为·OH直接抽氢机理，没有形成反应复合物的过程。从反应物到产物复合物是(·OH)·H2O的·OH直接抽氢原子23H形成H2O，亦即3C—23H键的断裂和24O—23H键的形成同时完成，反应能垒为68.4 kJ·mol-1。

2.1.2 b通道

在b通道，损伤历程见图2(b)，反应势能面剖面见图3的b线。首先，羟自由基水分子簇与S-Phe的23H和9O作用，形成复合物b_S-Phe·[(·OH)·H2O]。而后b_S-Phe·[(·OH)·H2O]经·OH 抽取23H的过渡态 b_TS·[(·OH)·H2O]，异构成产物复合物 b_P*·(H2O)2。最后b_P*和(H2O)2的分子间氢键解离，形成b_P*和二聚水(H2O)2。结构分析表明，b_P*·(H2O)2的1N、3C、5C、9O和21O形成了五中心共轭大π键，水分子间以及水分子与羰基氧间存在较强的氢键，水分子与α-碳之间存在弱氢键，其构象稳定。

从b_S-Phe·[(·OH)·H2O]到b_TS·[(·OH)·H2O]过程，3C—23H键长从0.109 3 nm拉伸至0.117 2 nm断裂，骨架二面角1N—3C—4C—5C从123.63°变为127.19°，化学键拉伸较小，活性中心骨架形变不明显，不需要太多的能量，过渡态的键角3C—23H—24O是172.64°，接近平角，3C—23H—24O具有较强的氢键，过渡态较稳定，因此b_TS·[(·OH)·H2O]产生的内禀能垒很低，只有29.5 kJ·mol-1。在此过程中，H2O分子也没有参与反应，其作用是稳定·OH的空间位置。从势能剖面中可以看出，从反应物 S-Phe+[(·OH)·H2O]到反应复合物 b_S-Phe·[(·OH)·H2O]的过程要吸热54.7 kJ·mol-1。b_P*和(H2O)2之间的氢键解离能是26.5 kJ·mol-1。同 2.1.1 节，b_S-Phe·[(·OH)·H2O]不稳定，该基元反应也可视为·OH直接抽氢，没有形成反应复合物的过程。·OH直接抽23H形成H2O，3C—23H键的断裂反应能垒为84.2 kJ·mol-1。

2.1.3 c通道

在c通道，损伤的反应历程见图2(c)，反应势能面剖面见图3的c曲线。首先是羟自由基与23H作用，形成复合物 c_S-Phe·(·OH)。而后 c_S-Phe·(·OH)经·OH 抽取23H的过渡态 c_TS·(·OH)，异构成产物复合物c_P*·H2O。结构分析表明，c_P*·H2O的1N、3C、5C、9O和21O形成了五中心大π键，水分子与羰基氧间存在较强的氢键，c_P*·H2O构象稳定。最后，c_P*和H2O的分子间氢键解离。

图3 羟自由基（水分子簇）抽α-H导致S-Phe损伤反应的势能面Fig.3 Potential energy surfaces of S-Phe damage induced by by α-H abstraction of hydroxyl radicals（water clusters）

从c_S-Phe·(·OH)到c_TS·(·OH)过程，3C—23H键长从0.109 4 nm拉伸至0.115 9 nm断裂，骨架二面角 1N—3C—4C—5C 从125.30°变为125.86°，基本没变。化学键拉伸较小，不需要较多的能量，3C—1N键长从0.146 1 nm收缩至0.144 0 nm，释放能量，过渡态的键角3C—23H—24O为177.85°，可视为平角，3C—23H—24O具有很强的氢键，过渡态很稳定，因此c_TS·(·OH)产生的内禀能垒很低，只有16.0 kJ·mol-1。从势能面剖面可以看出，从反应物S-Phe+(·OH)到反应复合物c_SPhe·(·OH)的过程要吸热68.9 kJ·mol-1。c_P*和H2O之间的氢键解离能为79.8 kJ·mol-1。

同 2.1.1 节，由于c_S-Phe·(·OH)不稳定，该基元反应也可视为·OH直接抽氢机理，·OH直接抽氢原子23H形成H2O，3C—23H的断裂和24O—23H键的形成同时完成，反应能垒为84.9 kJ·mol-1。

计算表明，a_P*、b_P*和c_P*P*的构象相同，亦即Phe分子在a、b和c通道的损伤产物相同。

从图3中可以看出，羟自由基（水分子簇）抽α-H致S-Phe损伤在a、b和c 3个反应通道的能垒分别为68.4，84.2和84.9 kJ·mol-1，通道 a能垒最低，产物复合物以及产物的能量均是a通道最低，因此，羟自由基水分子簇抽α-H致S-Phe损伤反应的a通道是优势反应通道。

2.2 羟自由基（水分子簇）抽β-氢致S-Phe损伤

羟自由基（水分子簇）抽取β-氢可分为羟自由基水分子簇与β-氢和氨基作用以及羟自由基与β-氢作用形成反应复合物，对应的抽氢反应分为2个通道，分别命名为d和e。研究表明，羟自由基（水分子簇）抽取的β-氢可以是7H或8H，反应机理基本相同，为节省篇幅，本工作只讨论羟自由基（水分子簇）抽取7H的情形，反应历程见图4，反应势能面剖面见图5，下面分别进行讨论：

2.2.1 d通道

在d通道损伤的反应历程见图4(a)，反应势能面剖面见图5的d曲线。

首先羟自由基水分子簇与S-Phe的7H和2H作用，形成反应复合物 d_S-Phe·[(·OH)·H2O]。而后d_S-Phe·[(·OH)·H2O]经·OH 抽取7H的过渡态d_TS·[(·OH)·H2O]，异构成产物复合物 d_P*·(H2O)2。d_P*是失去一个β-氢的产物自由基，SPhe失去7H后，5C及其附近的碳上的电荷分布与S-Phe明显不同，NPA电荷计算表明，它们的β-碳、α-碳和苯环上碳的电荷分布相差明显，其他骨架和非骨架原子上的电荷分布也有不同程度的改变，d_P*已不具有Phe的特性，亦即S-Phe损伤了，后面e通道的与此相似之处不再述说。结构分析表明，d_P*·(H2O)2的1N、3C、6C、10O和22O形成了五中心大π键，水分子间存在较强的氢键，水分子与氨基间存在中等偏强的氢键，水分子与苯环间存在中等偏弱的π氢键，其构象较稳定。但由于d_P*·(H2O)2的五中心大π键强度和分子间氢键强度不及a_P*·(H2O)2和b_P*·(H2O)2，所以，d_P*·(H2O)2的稳定性不及a_P*·(H2O)2和b_P*·(H2O)2，在势阱的位置也不是很深。

从d_S-Phe·[(·OH)·H2O]到d_TS·[(·OH)·H2O]，5C—7H键长从0.109 3 nm拉伸至0.114 4 nm断裂，骨架二面角11C—9C—5C—3C从－92.53°变为－81.80°，化学键拉伸较小，骨架形变较小，不需要太多能量，过渡态的键角5C—7H—24O为179.18°，接近平角，过渡态较稳定，因此，d_TS·[(·OH)·H2O]产 生的内禀能垒很低，只有27.3 kJ·mol-1。此过程 (·OH)·H2O中的H2O分子没有参与反应，其作用是稳定·OH的空间位置。从势能剖面中可以看出，从反应物 S-Phe+[(·OH)·H2O]到反应复合物d_S-Phe·[(·OH)·H2O]过程要吸热 62.0 kJ·mol-1。d_P*和(H2O)2之间的氢键解离能为11.0 kJ·mol-1。

图4 羟自由基（水分子簇）抽β-氢导致S-Phe损伤的反应历程（键长：nm）Fig.4 S-Phe damage mechanism induced by β-H abstraction of hydroxyl radicals（water clusters）（bond length：nm）

图5 羟自由基（水分子簇）抽β-氢导致S-Phe损伤反应的势能面Fig.5 Potential energy surfaces of S-Phe damage induced by by β-H abstraction of hydroxyl radicals（water clusters）

同 2.1.1 节，d_S-Phe·[(·OH)·H2O]不稳定，该基元反应也可视为·OH直接抽氢，·OH直接抽β-氢原子7H形成H2O，5C—7H键的断裂和24O—7H键的形成同时完成，反应能垒为89.3 kJ·mol-1。

2.2.2 e通道

在e通道，损伤的反应历程见图4(b)，反应势能面剖面见图5的e曲线。首先是羟自由基与7H作用，形成反应复合物 e_S-Phe·(·OH)。而后 e_SPhe· (·OH)经·OH抽 7H的过渡态 e_TS·(·OH)，异构成产物复合物e_P*·H2O。结构分析表明，e_P*·H2O的1N、3C、6C、10O和22O形成了五中心大π键，水分子与氨基间存在中等强度的氢键，水分子与苯环之间存在中等偏弱的π氢键，其构象较稳定。但由于e_P*··H2O的五中心大π键及氢键的强度不及c_P*·H2O，所以，e_P*·H2O的稳定性不及c_P*·H2O。从e_S-Phe·(·OH)到e_TS·(·OH)过程，键长5C—7H从0.109 4 nm拉伸至0.115 5 nm断裂，骨架二面角11C—9C—5C—3C从－93.31°变为－81.60°，化学键拉伸较小、骨架形变较小，不需要太多能量，过渡态键角5C—7H—24O为171.21°，接近平角，过渡态较稳定，因此e_TS·(·OH)产生的内禀能垒很低，只有21.9 kJ·mol-1。从势能剖面中可以看出，从反应物S-Phe+(·OH)到反应复合物e_S-Phe·(·OH)的过程要吸热 69.1 kJ·mol-1。e_P*和·H2O之间的氢键解离能是15.5 kJ·mol-1。

同 2.1.1 节，e_S-Phe·(·OH)不稳定，该基元反应也可视为·OH直接抽氢，·OH直接抽β-氢7H形成H2O，5C—7H键的断裂和24O—7H键的形成同时完成，反应能垒为91.0 kJ·mol-1。

从图5中可以看出，羟自由基水分子簇抽β-氢和羟自由基抽β-氢致S-Phe反应能垒为89.3～91.0 kJ·mol-1，损伤反应在竞争中不分伯仲，在误差允许范围内可认为相等。但考虑到水液相环境下羟自由基水分子簇的分布要多于羟自由基，羟自由基水分子簇抽β-氢致S-Phe损伤反应在竞争中应占主导地位。

与2.1节的羟自由基（水分子簇）抽α-氢致SPhe损伤相比较，本节的羟自由基（水分子簇）抽β-氢致S-Phe损伤处于劣势。主要原因是α-C-H键长（0.109 3 nm）大于β-C-7H键长（0.109 2 nm），NPA电荷计算表明，α-C正电荷量（－0.135 e）小于β-7H（－0.410 e），α-C-H键比β-C-7H的库伦作用弱，α-C-H键比β-C-7H键弱，容易断裂；NPA电荷计算表明，α-H正电荷量（0.253 e）大于β-7H正电荷量（0.231 e），羟自由基的氧原子对α-H的库仑引力大于对β-7H的库仑引力。

2.3 羟自由基抽苯环-氢致S-Phe损伤

羟自由基抽苯环-氢致S-Phe损伤命名为f通道。研究发现，羟自由基可以抽取苯环上的17H、19H和20H致S-Phe损伤（由于受氨基和羧基的影响，羟自由基抽取苯环上的13H和16H反应过程的驻点没找到），分别命名为f1、f2和f3通道，各通道的反应历程见图6，反应势能面剖面见图7。

对于f1通道，首先是羟自由基与苯环-氢17H作用，形成反应复合物f1_S-Phe·(·OH)。而后f1_S-Phe·(·OH)经·OH 抽取氢原子 17H的过渡态f1_TS·(·OH)，异构成产物自由基复合物f1_P*·H2O。结构分析表明，f1_P*·H2O的1N、3C、6C、10O和22O没形成大π键，f_1P*和H2O之间的作用比较弱，失去氢原子的苯环碳具有比较强的获取氢原子的能力，f1_P*·H2O和f_P*的构象都不稳定。

图6 羟自由基抽苯环-氢导致S-Phe损伤的反应历程（键长：nm）Fig.6 S-Phe damage mechanism induced by benzene ring-H abstraction of hydroxyl radicals（water clusters）（bond length：nm）

从f1_S-Phe·(·OH)到f1_TS·(·OH)过程，14C—17H键长从0.108 5 nm拉伸至0.120 3 nm断裂，化学键拉伸较小，所需能量较少，过渡态的键角14C—17H—24O为169.96°，接近平角，14C—17H—24O的氢键较强，过渡态较稳定，f1_TS·(·OH)产生的内禀能垒很低，只有7.0 kJ·mol-1。从势能面上可以看出，从反应物S-Phe+(·OH)到反应复合物f1_S-Phf·(·OH)吸热 104.6 kJ·mol-1，f1_P*和H2O 之间的氢键解离能为2.4 kJ·mol-1，f1_P*·H2O的分子间氢键作用极弱，f1_P*·H2O很容易通过碰撞解离成f1_P*和H2O。

同 2.1.1节，f1_S-Phf·(·OH)不稳定，该基元反应也可视为·OH直接抽氢，·OH直接抽取苯环-氢的原子17H形成H2O，14C—17H键的断裂和24O—17H键的形成同时完成，反应能垒为111.6 kJ·mol-1。

f3通道的机理类似于f1通道，从反应物SPhe+(·OH)到反应复合物 f3_S-Phe·(·OH)过程要吸热 107.9 kJ·mol-1，过渡态较 f3_TS·(·OH)产生的内禀能垒为4.7 kJ·mol-1，产物自由基f3_P*和H2O之间的解离能为0.7 kJ·mol-1，说明 f1_P*·H2O的分子间存在的是范德华作用，f1_P*·H2O很容易被解离为f1_P*和H2O。

f2通道不同于f1和f3通道，反应复合物f2_S-Phf·(·OH)极不稳定，其相对于反应物 S-Phe+(·OH)的能量为120.2 kJ·mol-1，比过渡态 f2_TS·(·OH)的能量还高，该通道的损伤反应在通常情况下很难实现，产物复合物f1_P*·H2O也极易解离。

从图7中可以看出，f2通道明显处于劣势，羟自由基抽取苯环-氢致S-Phe损伤反应的能垒为120.2 kJ·mol-1，如此高的能垒很难越过。在f1和f3通道，羟自由基抽取苯环-氢致S-Phe损伤反应的能垒分别为111.6和112.6 kJ·mol-1，与2.1和2.2节中的羟自由基（水分子簇）抽α-氢和β-氢致S-Phe损伤相比均处于劣势。主要原因有2个：（1）苯环的C—H键长短（苯环的C—H键长约为0.108 5 nm，α-C—H键长为0.109 3 nm，β-C—7H键长为0.109 2 nm)，苯环的C—H键较强，不容易断裂；（2）苯环-H的正电荷量最小（NPA电荷计算表明，苯环-H正电荷量约为0.225 e，α-H正电荷量为0.253 e，β-7H正电荷量为0.231 e），羟自由基的氧原子对苯环-H的库仑引力最弱。从图7中还可看出，Phe在f1，f2和f3通道的损伤可自行修复。

2.4 羟自由基加成到苯环致S-Phe损伤

羟自由基与苯环加成可分为羟自由基在Phe分子内侧和外侧加成到苯环碳上2种情况，对应的反应通道分别命为g和h。

2.4.1 羟自由基在S-Phe内侧加成到苯环

图7 羟自由基抽苯环-氢导致S-Phe损伤反应的势能面Fig.7 Potential energy surfaces of S-Phe damage induced by benzene ring-H abstraction of hydroxyl radicals（water clusters）

图8 羟自由基加成到苯环C导致S-Phe损伤的反应历程（键长：nm）Fig.8 S-Phe damage mechanism induced by the addition of hydroxyl radicals to benzene ring C（bond length：nm）

研究表明，羟自由基在内侧加成到14C和15C位点的情况基本相同，而在9C、11C和12C的加成没有找到理想的驻点，本节只讨论羟自由基加成到14C和18C位点的情况，分别命名为g1和g2通道，反应历程见图8(a)，反应势能面见图9(a)，下面分别进行讨论。

对于g1通道：首先羟自由基与14C作用，形成复合物 g1_S-Phe·(·OH)。而后 g1_S-Phe·(·OH)经·OH加成到14C的过渡态g1_TS·(·OH)，异构成产物g1_P*。g1_P*与S-Phe的结构明显不同，NPA电荷计算表明，它们在苯环上的电荷分布相差明显，g1_P*是损伤了的S-Phe。后面相似之处不再赘述。

图9 羟自由基加成到苯环导致S-Phe损伤反应的势能面Fig.9 Potential energy surfaces of S-Phe damage induced by the addition of hydroxyl radicals to benzene ring C

从g1_S-Phe·(·OH)到g1_TS·(·OH)过程，14C—24O键长从0.262 8 nm压缩至0.210 3 nm，需外界提供能量克服库仑斥力做功，骨架二面角18C—14C—15C—12C从179.15°变为176.21°，碳氧键压缩不是很大，需要的能量不很高，因此，g1_TS·(·OH)产生了33.2 kJ·mol-1的内禀能垒。从势能剖面中可以看出，从反应物S-Phe+(·OH)到复合物g1_S-Phe·(·OH)过程要吸热 73.5 kJ·mol-1。g1_SPhe·(·OH)不稳定，该基元反应也可视为不经过反应复合物，·OH直接经过渡态加成到14C，反应能垒为106.7 kJ·mol-1。

对于g2通道，首先羟自由基与18C作用，形成复合物 g2_S-Phe·(·OH)。而后 g2_S-Phe·(·OH)经·OH加成到18C的过渡态g2_TS·(·OH)，异构成产物 g2_P*。g2_TS·(·OH)产生了43.2 kJ·mol-1的内禀能垒。g2_TS·(·OH)产生的内禀能垒大于g1_TS·(·OH)产生的，原因是从g2_S-Phe·(·OH)到g2_TS·(·OH)过程，18C—24O键长从0.278 6 nm压缩至 0.210 3 nm，与从g1_S-Phe·(·OH)到g1_TS·(·OH)过程14C—24O键长的压缩情况相比较，末状态键长 18C—24O 相同，初状态 g2_S-Phe·(·OH)的18C—24O 距离远，从g2_S-Phe·(·OH)到g2_TS·(·OH)过程需提供抵抗静电力做功的能量要多。

类似于g1通道，该基元反应也可视为不经过反应复合物，·OH直接经过渡态加成到18C，反应能垒为110.2 kJ·mol-1。

2.4.2 羟自由基在S-Phe外侧加成到苯环

研究表明，羟自由基在外侧加成到11C、12C、14C和15C的情况基本相同，在9C的加成没有找到理想的驻点，在此只讨论羟自由基加成到14C和18C的情况，分别命名为h1和h2通道，反应历程见图8(b)，反应势能面见图9(b)，反应机理与在g1和g2通道的相似，只做一般讨论。

对于h1通道：首先是羟自由基与14C作用，形成反应复合物 h1_S-Phe·(·OH)。而后 h1_S-Phe·(·OH)经过渡态 h1_TS·(·OH)，异构成产物 h1_P*。从h1_S-Phe·(·OH)到h1_TS·(·OH)过程，14C—24O键长从0.257 6 nm压缩至0.209 8 nm，h1_TS·(·OH)产生的内禀能垒为31.7 kJ·mol-1。从势能剖面中可以看出，从反应物S-Phe+(·OH)到反应复合物 h1_S-Phe·(·OH)的过程要吸热76.8 kJ·mol-1。该基元反应也可视为不经过反应复合物，·OH直接经过渡态加成到14C，反应能垒为108.5 kJ·mol-1。

对于h2通道，先是羟自由基与18C作用，形成复合物 h2_S-Phe·(·OH)。而后 h2_S-Phe·(·OH)经过渡态 h2_TS·(·OH)，异构成产物 h2_P*。h2_TS·(·OH)产生的内禀能垒为25.3 kJ·mol-1。h2_TS·(·OH)较 h1_TS·(·OH)产生的内禀能垒小。原因是从h2_S-Phe·(·OH)到h2_TS·(·OH)过程中，18C—24O的压缩距离小，并且h2_S-Phe·(·OH)的键长18C—24O 小于h1_S-Phe·(·OH)的键 长 18C—24O，h2_TS·(·OH)的键长 18C—24O 大于h1_TS·(·OH)的键长18C—24O。从h2_S-Phe·(·OH)到h2_TS·(·OH)需提供抵抗静电力做功的能量少。该基元反应也可视为不经过反应复合物，·OH直接经过渡态加成到18C，反应能垒为106.5 kJ·mol-1。从图9中可以看出，在误差允许的范围内，羟自由基在苯丙氨酸的内侧和外侧加成到14C和18C致SPhe反应损伤的能垒基本相同。从图9中还可以看出，这几个反应的产物基本与反应物处于势能面的同一高度。因此，羟自由基在苯丙氨酸的内侧和外侧加成到14C和18C致S-Phe损伤的反应在竞争中不分伯仲。

3 结 论

3.1 羟自由基诱导的S-Phe分子损伤反应有羟自由基（水分子簇）抽取α-氢、β-氢、苯环-氢以及羟自由基与苯环加成4种途径。这4种途径又分别有a、b和c通道，d和e通道，f1、f2和f3通道；g1、g2、h1和h2通道。

3.2 在a、b和c通道的竞争中，a通道具有优势，反应的能垒为68.4 kJ·mol-1，放热 98.0 kJ·mol-1。d和e通道的竞争不分伯仲，反应的能垒在89.3～91.0 kJ·mol-1，放 热在 54.9～57.3 kJ·mol-1。f1、f2和f3 反应通道的能垒在111.6 kJ·mol-1左右，是吸热反应。g1、g2、h1和h2通道的竞争也不分伯仲，反应能垒在106.5～110.2 kJ·mol-1，吸放热情况不明显。在所有的反应通道竞争中，a通道最具优势。

结果表明，羟自由基（水分子簇）抽取α-氢是Phe分子损伤的主要途径。