微生物肥料对西红花生长及代谢物的影响

饶君凤，吕伟德，宋涛

（1.杭州职业技术学院，浙江杭州310018；2.杭州富阳厚鑫生态农业开发有限公司，浙江杭州311404）

西红花又名番红花和藏红花，药用部位为其柱头，西红花能活血、解郁、安神，是2014年我国新增的药食两用贵重中药，有红色金子之称，同时，因其独特的香气和良好的食品增色调味作用，又被称为世界上最贵的香料。浙江省是我国西红花的主产区，各级政府部门均制定了相关政策大力促进西红花产业的健康快速发展，由于西红花在栽培条件下不能结实，仅靠球茎无性繁殖，繁殖过程中种球品质退化严重，加上西红花种植过程存在严重的连作障碍，制约了西红花产业的持续发展和壮大[1]。已有研究认为，根系分泌物的自毒作用[2]以及由此诱发的土传病害病原生物的选择性促进[3]是导致土壤微生态系统失衡及作物连作障碍的主要原因。通过有益微生物的直接引入或通过增施有机肥，间接改善土壤微生态的多样性，是防治连作障碍的有效方法[4]，其中增施含有自毒物质高效降解菌的有机肥是目前研究较多的用于连作障碍防治的有效途径[5]。研究表明，微生物群落结构与组成变化会直接影响土壤功能的发挥[6]；根际微生物的数量、活性和群落结构及其变化,直接影响植物吸收水分、养分及其对恶劣环境的抵抗能力，并与病菌的侵入和感染密切相关[7]，因此，土壤微生态系统综合功能失调是造成连作障碍的主要原因，探索土壤微生物生态调控途径是消减连作障碍的关键。本实验研究了不同微生物肥料对西红花产量的影响，并采用代谢组学技术研究了其对西红花球茎代谢物的影响，以期为西红花微生物生态的成功调控及其连作土壤的生物修复提供参考，进而为克服与治理名贵中药材西红花及其他中药材与农作物生产中的连作障碍提供有效的技术支撑。

1 材料与方法

肥料a：重茬净复合微生物菌剂，500 g/包，武汉埃格瑞生物工程技术有限公司；肥料b：微生物菌剂（广谱型），500 g/包，潍坊市绿陇生物技术有限公司；肥料c：锦能菌宝608，锦江化工（山东）有限公司，2 000克/袋，以上3种菌肥均购自淘宝网。肥料d：自制活性生物肥料，2 500 g/袋，由课题组人员在前期西红花自毒物质降解菌研究基础上，采用4株多功能降解细菌作为自制活性生物肥料生产菌。4株多功能降解细菌分别为暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis B1-6、解淀粉芽孢杆菌WZZ-6、绿针假单胞菌 DSY3B6、Arthrobacter nicotinovorans SSDB1。采用单因子实验和正交实验对4个菌株的发酵条件分别进行优化，确定各自的发酵培养条件后进行发酵，对这4种发酵菌体等比例混合后制成活性微生物，再加入少量基质，充分混匀后，通风晾干或低温烘干，制成自制活性生物肥料（微生物总数达到108以上）。

浇灌用水为建德三都新和实验田地日常浇灌使用的溪水。

JCS-600电子天平，生产编号：1418208，生产日期：201408，凯丰集团有限公司制造。

2 实验设计与取样

西红花参试品种为建德新和西红花专业合作社自留的建德种西红花，种植在合作社承包的连续种植5 a以上的田地。试验中使用的4种菌肥分别为重茬净（肥料a）、微生物菌剂（肥料b）、锦能宝（肥料c）和自制活性生物肥料（肥料d）。将一包菌肥分别均匀溶解在2桶水中，每桶水40 L，共80 L，采用灌注方式施肥，设空白对照。各处理均重复3次，每个重复均有10行西红花，每行均种有种球10株（平均每株产2个种球），试验组与对照组随机分布在同一块田中，且两组之间间隔距离较远。施过菌肥的除不再喷农药外，其余管理与对照组相同。菌肥处理时间为2016年2月15日，处理62 d后即4月17日取球茎进行代谢物分析。具体取样过程为：一种菌肥试验每个平衡取3株（一般每株有2个球，个别的只有1个球），将球在清水中洗净后，3株中每株切一小片球茎混合成一个样品，共取3个平衡，对照组用同样方法取样，取样时尽量选取外形、长势相似的植株，将样品放在信封里用订书机封好，再将信封浸入液氮中然后捞出埋在干冰中，当天下午从建德取样地寄往上海渊谱生物科技有限公司进行代谢物分析。处理后的75 d即4月30日在西红花叶子接近枯萎可以采种球时，对种球和种球根际土壤进行取样，每个样本采集2行×3种球和泥土，共5个样本，一般取中间2行，即同时分别取每个微生物肥料试验组10行中的第5～6行，共挖取2行种球和泥土，一个微生物肥料取6行种球和泥土，将泥土直接送检测机构做宏基因组测序，共取了重茬净（肥料a）、微生物菌剂（肥料b）和自制活性生物肥料（肥料d）3种菌肥泥土。另将这些种球按施不同微生物肥料分别放置，每个施微生物肥料的西红花种球只算总数不再设平衡，7月27日在种球的泥土和其他杂质全部自动脱落后对每个种球进行称重。

3 代谢组分分析

准确称取10 mg西红花球茎粉末样品移至2 mL离心管中，加入 600 μL的甲醇:水（v:v=4:1）溶液，涡旋 3 min 后温室静置 10 min，12 000 r·min-1离心。取上清，12 000 r·min-1离心后取100 μL 进行UHPLC（1290 Infinity II LCTM，安捷伦）分析。流动相为A（0.1%甲酸水溶液）和B（100%乙腈），洗脱梯度为0 min，98.0%A；1.0 min，98%A；5.0 min，60%A；12.0 min，30%A；15.0 min，5%A；20.0 min，5%A，流速为0.40 mL·min-1，上样量为1 μL。

采用6545 Q-TOF系统（安捷伦）进行代谢物分析。参数为：质荷比50～1 000；扫描速度为2张·s-1；毛细管电压3.5 kV，喷头电压500 V（正离子模式），1 500 V（负离子模式）；碰撞电压110 V，喷雾器压强45 Pa，流速8 L·min-1；二级质谱碰撞电压分别为10，20，40 V。结合 Masshunter Qual软件（安捷伦）及代谢组数据库对代谢物进行检验分析。筛选标准为：质荷比小于5×10-6，保留时间小于0.1 min。随后采用Mass Profinder 08（安捷伦）提取代谢物峰面积。数据分析前，采用归一化方法对代谢物进行标准化处理。利用SIMCA 13.0软件进行PCA分析，采用Excel 2013进行T-检验，p＜ 0.05表示各代谢物在处理间存在显著差异。

4 宏基因组测序

使用OMEGA E.Z.N.A DNA试剂盒提取西红花根际土壤基因组DNA；采用Epicentre公司的Copy Control TM Fosmid Library Production Kit构建宏基因文库；使用IllumunaMiseq测序平台，采用PE300测序方案，进行高通量测序；采用prinseq软件去除每个样品中片段短和低复杂度序列、引物序列和低质量序列；采用pri.cluster软件对测序错误进行校正；以silva数据库中序列为模板，利用uchime软件去除嵌合体；采用uclust（uclust v1.1.579）进行OTU聚类；采用RDP classifier软件进行物种分类。以上具体操作步骤详见文献[8]。

对群落中物种的Alp Ha多样性指标（ACE、Chao1、Shannon指数、Coverage）进行分析，具体步骤详见文献[8,11]。通过QIIME软件，采用迭代算法对高通量测序数据进行Beta多样性指标分析，本文采用加权重计算方式，具体步骤详见文献[12]。

5 结果

5.1 不同微生物肥料对西红花产量的影响

由表1可见，与对照组相比，4种微生物肥料均能降低无效球重量，提高有效球重量比。其中，施用重茬净的效果最好，施用锦能菌宝608次之，施用微生物菌剂效果最差但高于对照组。

表1 不同微生物肥料对西红花产量的影响Table1 Effect of different microbial fertilizers on yield of saffron

5.2 不同微生物肥料对西红花球茎代谢物的影响

本实验中，共鉴定到129种代谢组。由图1可知，经4种菌肥处理后的西红花球茎代谢物均与对照组存在显著差异，其中自制活性生物肥料（肥料d）与对照组差异最大，而重茬净（肥料a）与对照组差异最小。

与对照组相比，菌肥a处理后，2种代谢物量上升显著（腺苷5′-单磷酸和葡萄糖 1-磷酸），2种代谢物量下降显著（原儿茶酸O-己糖苷2和2,6-二氨基庚二酸）（见表1）。菌肥b处理后，琥珀酸、延胡索酸和苹果酸量上升显著，而原儿茶酸O-己糖苷2、咖啡酸和犬尿氨酸量则下降显著。菌肥c处理后，分别有3个代谢物量上升（乙酰、脯氨酸和同型半胱氨酸），2个代谢物量下降（原儿茶酸O-己糖苷2和甘油酸）。与对照组相比，菌肥4处理后，西红花球茎代谢物差异最大，分别有包括泛酸、共轭亚油酸、维生素B2、抗坏血酸和松油酸等在内的13个代谢物量上升显著，而原儿茶酸O-己糖苷2甘油酸果糖和蔗糖的量下降显著，详见表2。

5.3 不同微生物肥料对根际微生物生态的影响

通过测定各个土壤样品的细菌种群结构组成，以比较所研制的自制活性生物肥料对根际土壤细菌种群的影响。如表3和表4所示，不同处理的土壤与对照相比，在门水平上具有一定差异，主要表现在各处理组的变形菌门、放线菌门增加，酸酐菌门、拟杆菌门减少；在属水平上的表现为Sphingomonas、Gemmatimonas、Nitrosospira、Acinetobacter、Bacillus明显增加,Gp6、Gp3、Exiguobacterium、Citrobacter、Pseudomonas等呈减少趋势。从中可看出，经处理之后，根际土壤中好酸性的细菌呈减少趋势，而嗜中性或碱性的细菌呈增加趋势，表明增施生物肥料具有缓解西红花连作障碍的功效。

图1 不同微生物肥料处理后西红花球茎化合物的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of differential accumulated metabolites in saffron bulbs after different microbial fertilizer treatment

6 讨 论

西红花采收前采集各实验组根际土壤，采用第二代高通量测序方法，测定各土壤样品的细菌种群结构组成，发现施用微生物肥料后根际土壤中好酸性的细菌有减少趋势，而嗜中性或碱性的细菌有增加趋势，表明增施生物肥料或自制活性生物肥料具有缓解西红花连作障碍的功效。通过与对照组比较，4种微生物肥料均显著提高了西红花有效球重量比，其中重茬净的效果最佳，微生物肥料的抗连作障碍作用在产量上得到了证实。

通过分析代谢物发现，在重茬净处理后，腺苷5′-单磷酸和葡萄糖 1-磷酸量显著上升。腺苷5′-单磷酸是植物体内合成ATP的重要底物，在腺苷酸激酶的作用下与二膦酸腺苷合成ATP。葡萄糖1-磷酸是植物体内合成淀粉的重要物质[13]。这2种代谢物的上升可能对提高西红花产量有重要作用。除此之外，还发现原儿茶酸O-己糖苷2在各种微生物肥料处理后均有显著下降，原儿茶酸O-己糖苷2的降低对西红花产量的影响需进一步研究。除重茬净外，其他3种微生物肥料也能提高西红花产量，在球茎代谢物分析中，发现不同代谢物有表达差异，表明以上4种微生物肥料能够通过调控不同代谢物的积累影响产量。而4种微生物肥料是如何调控以上代谢物的尚需进一步研究。从代谢组数据中发现，经过自制活性生物肥料处理的西红花球茎引起的代谢物差异最多，但产量并非最佳。因此，不同微生物肥料造成的代谢物差异是如何影响西红花产量的尚待进一步深入研究。

表2 不同微生物肥料处理后西红花球茎积累化合物的变化Table2 Up-and down-accumulated metabolites after different microbial fertilizer treatment

表3 不同微生物肥料处理对根际土壤细菌宏基因组的影响（Phylum门水平）Table3 Effect of different microbial fertilizers on rhizosphere soil bacterial metagenomics（Phylum level）

本研究中，施用不同微生物肥料会影响土壤的细菌种群结构。例如，好酸性的细菌减少，而嗜中性或碱性的细菌增加。但微生物肥料是如何影响西红花根际微生物种群结构的有待进一步研究。以上研究结果对缓解西红花连作障碍具有一定的指导意义。