一株鸡源新城疫病毒的分离鉴定

王 昊，孙德君

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150000）

新城疫病毒属于副黏病毒科、副黏病毒属中的一个种。该病毒主要危害鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降。该病毒是一种有囊膜的单股、负链RNA 病毒。病毒粒子具多形性，一般呈近似球形，直径100～300 nm，有时也可呈长丝状[1-3]。包膜为双层结构膜，由宿主细胞外膜的脂类与病毒糖蛋白结合衍生而来。包膜表面有长12～15 nm 的刺突，具有血凝素、神经氨酸酶。病毒的中心是蛋白质衣壳粒，缠绕成螺旋对称的核衣壳，直径约18 nm。成熟的病毒是以出芽方式释放至细胞外。其对外界环境的抵抗力较强，55 ℃作用45 min 和直射阳光下作用30 min 才被灭活。病毒可在4 ℃中存放几周，在-20 ℃中存放几个月或在-70 ℃中存放几年，其感染力均不受影响。在新城疫暴发后8 周之内，仍可在鸡舍、蛋巢、蛋壳和羽毛中分离到病毒[4-5]。新城疫病毒对乙醚、氯仿敏感。大多数常用消毒剂能将其迅速灭活。氢氧化钠等碱性物质对其消毒效果不稳定。来苏尔3%～5%、酚和甲酚5 min内可将裸露的病毒粒子灭活。在37 ℃的孵卵器内，用0.1%福尔马林熏蒸6 h即可将其灭活。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料

病料采自湖北某养殖厂病死鸡的肝脏、肺脏、脾脏。

1.1.2 病毒及血清

鸡新城疫病毒La Sota 株，购自中国兽医药品监察所。鸡新城疫标准阳性血清和禽流感标准阳性血清（H5、H9），购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 鸡胚

10日龄SPF鸡胚，由哈药集团生物疫苗有限公司提供。

1.1.4 红细胞

健康鸡红细胞，由哈药集团生物疫苗有限公司质量管理部提供。

1.1.5 主要试剂

提取核酸试剂盒，TaKaRa MiniBEST Viral RNA∕DNA Extraction Kit Ver 5.0。

1.1.6 主要试验器材

脉动真空灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司，XG1.1型）；电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司，DGX-9623BC-1 型）；数显电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，HPX-9162 MBE 型）；PCR 仪（美国BIO-RAD公司，S1000型）；ChemiDoc XRS凝胶成像系统（美国BIO-RAD 公司，ChemiDoc RAD 型）；生物洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，BCM-1300A型）；冷冻高速离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，Lengend Micro 21R）；电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，AL204-IC型）。

1.2 试验方法

1.2.1 病料处理

取出病死鸡的肝脏、肺脏和脾脏，放入灭菌容器中，加入PBS 液10 mL 进行研磨，然后放入-20 ℃反复冻融3次，3 000 r·min-1离心10 min，收集上清液，加青霉素、链霉素使其浓度为1 000 U·mL-1，4 ℃过夜后置-20 ℃保存备用。

1.2.2 鸡胚的接种传代

取10 日龄鸡胚5 枚，用1 mL 注射器吸取处理好的病毒上清液，尿囊腔接种鸡胚（0.2 mL·胚-1），37 ℃恒温培养箱培养120 h，24 h 进行照胚，将24 h内的死亡鸡胚弃去，收集48～120 h内死亡的鸡胚，观察病变，同时无菌收集尿囊液，杂检后放入-20 ℃冰箱保存备用。按照以上方法连续传3代，收集第3代的尿囊液进行鉴定。

1.2.3 血凝抑制实验

按现行《中国兽药典》规定的方法进行红细胞凝集试验（微量法），测定无菌收集尿囊液的血凝价，再用NDV 阳性血清和AIV（H5、H9）阳性血清进行血凝抑制实验。

1.2.4 血清中和实验

将分离株的鸡胚尿囊液分别用灭菌生理盐水稀释1 000 倍，各取1 mL 病毒稀释液分别与等量10 倍稀释的新城疫标准阳性血清和AIV 标准阳性血清充分混匀后于37 ℃作用1 h，同时设置上述灭菌生理盐水稀释1 000 倍尿囊液作为对照组，每组接种10 日龄SPF 鸡胚5 只，每胚接种0.1 mL，37 ℃孵育，接种后每天照蛋2 次，观察120 h。死胚随时取出，置4 ℃冰箱。测定所有鸡胚尿囊液的血凝价。

1.2.5 分离病毒EID50测定

将第3代病毒尿囊液做10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8 3个稀释度，各尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1 mL，置37 ℃继续孵育。弃去24 h 死亡的鸡胚，接种48～120 h 死亡的鸡胚随时取出，至120 h，取出所有活胚，逐枚收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1：128 者判为感染，按Reed-Muench法计算EID50[6]。

1.2.6 PCR引物的设计与合成

参照GenBank 上已发表的NDV 的F 基因序列，用Primer 5.0软件设计相应的特异性引物，用于扩增F基因重要功能区序列，其中上游引物F1：5'-TGTA GTAACGGGAGACAAAGCAG-3'；下游引物F2：5'-GAATAAATACCAGGAGACATAGGGA-3'。预计扩增出350 bp的F基因序列。引物交吉林库美生物科技有限公司合成，合成的引物用1 mL·L-1DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水稀释至终浓度为20 µmol·L-1，-20 ℃保存备用。

1.2.7 病毒RNA的提取及PCR检测

参考TaKaRa MiniBEST Viral RNA∕DNA Extraction Kit 说明书对鸡胚尿囊液进行病毒基因组RNA的提取，其具体步骤如下：取200 µL 病毒原液，加入200µL的Buffer VGB，20µL的Proteinase K和1µL 的Carrier RNB，充分混合均匀56 混水浴温浴10 min。然后向裂解液中加入200µL无水乙醇，充分吸打均匀。将Spin Column 安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12 000 r·min-1离心2 min，弃滤液。将500µL 的buffer RWA 加入至Spin Column 中，12 000 r · min-1离心1 min，弃滤液。将700µL 的buffer RWB 加入至Spin Column中12 000 r·min-1离心1 min，弃滤液。重复操作该步骤1次。将Spin Column安置于collection Tube上，12 000 r · min-1离心2 min。将Spin Column 安置于新的1.5 mL RNase free collection tube 上，在Spin Column膜的中央加入35 mL的RNase free dH2O，室温静置5 min。12 000 r·min-1离心2 min 洗脱病毒RNA。将下液重新加入到Spin Column 膜的中央，室温静置2 min 后，12 000 r·min-1离心2 min 洗脱病毒RNA。

按照Easy Script First-Stand cDNA Synthesis Super Mix反转录试剂盒的说明将RNA反转录成cDNA，其具体步骤如下：取14.5µL上述提取所得的RNA，加入2µL 的Oligo（随机引物），充分混匀于70 ℃水浴5 min，然后置于-20 ℃反应5 min。像上述反应液中加入5 µL 的5×Buffer、2 µL 的dNTP、0.5µL的RNAi和1µL的mLV，充分混匀于37 ℃水浴1 h。将上述反应液于95 ℃水浴5 min，终止反应，获得cDNA。

以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系为：

F 片段反应程序：混匀后，稍微离心，95 ℃5 min，预变性后，进行下列循环反应。

94 ℃ 50 s 变性

49 ℃ 50 s 退火

72 ℃ 1 min 延伸

35个循环后72 ℃延伸10 min。

1.2.8 凝胶电泳

PCR 产物用15 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测（将配置好的15 g · L-1琼脂糖凝胶，熔化后倒入已封好、插入样品梳的电泳槽中，冷却凝固后拔出样品梳，用微量移液器取所得PCR 产物10µL 于15 g·L-1琼脂糖凝胶电泳，条件为100 V、0.02 mA，电 泳15 min，观察所扩增片段）。将琼脂糖溶液（15 g·L-1）倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般为3～5 mm。倒入30 mL 琼脂糖 溶液。

在室温下使胶凝固，约30 min。取适量PCR产物与6×上样缓冲液混匀用微量移液枪小心加入样品槽中。上样量根据样品浓度可适当调整， 若DNA 含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40µL 为上限，大孔200 µL 为上限，具体和制胶膜规格 相关）。每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。加完样后，合上电泳 槽盖，立即接通电源。控制电压保持在110 V， 电流＞40 mA。当条带移动到距凝胶前沿约2 cm 时（约40 min），停止电泳。紫外光下拍照并观察。

2 试验结果

2.1 病毒的分离

接种的鸡胚在48～96 h 有死亡鸡胚，解剖后发现死亡鸡胚和正常鸡胚相比发育较小，整个胚体充血，在头、颈、腹、背、翅和趾部有出血点，尤其颈部非常明显。

2.2 血凝和血凝抑制结果

该毒株具有血凝性，血凝效价为7～8。病毒株的血凝性可被NDV 的阳性血清所抑制，但不能被禽流感病毒的阳性血清所抑制从而可以判定分离的毒株为NDV毒株。

2.3 分离毒的EID50结果

分离毒的EID50结果为107.83·0.1 mL-1。

2.4 病毒PCR鉴定结果

用琼脂糖凝胶电泳对PCR 产物进行检测，结果分离毒株在约350 bp 处均可见到清晰的目的条带，见附图，与预期结果相符。

附图 HB1910株PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测结果

3 讨 论

本试验在发病鸡群中分离到一株病毒，能与鸡红细胞发生凝集反应，可被新城疫标准阳性血清所抑制，不能被禽流感标准阳性血清所抑制，从而判定该病毒为鸡新城疫病毒。本试验为发病鸡场更准确的找到了鸡群发病的原因，可针对此原因制定综合防治措施。

新城疫的防治主要通过疫苗免疫接种，制定科学合理的免疫程序对新城疫的防控至关重要。免疫鸡群也可以发生新城疫病毒感染，往往由于母源抗体干扰免疫效果导致免疫失败。因此，新城疫疫苗免疫要掌握好免疫时机，避开母源抗体高峰期，一般可以对鸡群的母源抗体效价进行监测，如果抗体效价高于25则不产生免疫应答，在23的时候免疫接种可以产生良好的免疫效果。

新城疫病毒是家禽最常见的病毒性传染病，各种家禽普遍易感，各种年龄鸡都可感染，幼鸡和雏鸡更易感。本病春秋两季高发，鸡群一旦发生强毒感染，一般很难净化。平时需要做好养殖场的环境卫生，保持鸡舍的温度，通风良好，一旦发生患病鸡要及时隔离。此外，防治新城疫要采取严格的生物安全措施，加强引种方面的监管，防止新城疫强毒进入家禽群，做好定期的免疫接种工作，提高禽群特异性免疫效果。