YKL-40在卵巢癌细胞生长中的作用

梅琳琳，王雅莉，李红娟，张慧

（郑州大学附属郑州中心医院妇产科，河南 郑州 450007）

近年来临床上卵巢癌的发生风险明显上升，同时卵巢癌患者的生存预后指标并无明显的改善。流行病学研究证实，卵巢癌的平均发病率维持在252~727/10万人左右,在具有卵巢恶性上皮性肿瘤家族史的女性群体中,卵巢病变的风险可进一步上升[1]。肿瘤相关蛋白的表达，能够影响上皮细胞的早期增殖调控、癌细胞的粘附能力或者浸润能力,进而参与到生殖系统恶性肿瘤的发生过程。人类软骨糖蛋白 （YKL-40）是重要的分泌型糖蛋白，其能够通过结合细胞膜上的糖蛋白配体，激活细胞膜内的多种信号通路,导致上皮细胞的增殖速度的改变[2,3]。基础方面的研究证实，YKL蛋白能够诱导癌细胞的分化成熟障碍,导致癌细胞对于基底膜组织的突破风险明显的增加[4]。少量的研究探讨了YKL-40蛋白在子宫内膜癌或者甲状腺癌等中的表达情况，发现YKL-40表达浓度的上升是促进恶性肿瘤发生及临床预后恶化的重要风险[5]，但在卵巢癌中的分析研究不足。为了揭示卵巢癌的发病机制，分析YKL-40蛋白在促进卵巢癌发生过程中的作用，本次研究分析了YKL-40蛋白在卵巢癌细胞SKOV3中的表达情况及其对于SKOV3细胞的侵袭、化疗敏感性等的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株 卵巢癌细胞SKOV-3，已确认表达YKL-40的人恶性胶质瘤细胞U87作为阳性对照，均购自上海生命科学研究院。

1.2 细胞培养

1.3 构建YKL-40过表达细胞 采用无内毒素质粒提取试剂盒提取和纯化EPMI重组质粒及YKL-40质粒，测定浓度，将人恶性胶质瘤细胞U87或者卵巢癌上皮细胞SKOV3铺于六孔板上，隔日更换培养瓶PRIM60，在细胞融合度为75%~80%时加入脂质体和构建的质粒，并进行筛选，定期更换培养基清除死亡的细胞。

1.4 细胞迁移试验 采用细胞刮将上室内细胞轻轻刮去,采用磷酸盐缓冲液洗两次,每次3min，行多聚甲醛固定液固定,结晶紫染色后显微镜下观察，随机选3个视野,计数穿膜细胞，根据每个区域的细胞数量计算细胞侵袭能力。

1.5 Western blot检测 采用细胞裂解液裂解收集的细胞集落,裂解蛋白与上样缓冲液以5：1的浓度相互混合，80~100℃煮沸5min。根据不同的蛋白分子量水平,配制并灌注相应的12%的分离胶和5%的浓缩胶,按15g／孔蛋白量进行组织蛋白的上样，进行SDS．PAGE电泳,电泳后根据条带进行切胶,半湿法转移至硝酸纤维素膜，BSA蛋白封闭2h，加入含 10%BSA一抗及二抗（1：1000），磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5min，进行曝光及胶片弧度的读取。

1.6 CCK-8试验 在96孔板中接种细胞悬液（100μl/孔），向每孔加入 10μl CCK8 溶液，将培养板在培养箱内孵育1~4h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1%w/v SDS溶液，24h内测定，吸光度不会发生变化。

1.7 统计学处理 统计分析采用SPSS19.0软件，计量资料采用（)表示，两组间比较使用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SKOV-3和U87细胞YKL-40蛋白表达比较SKOV-3细胞YKL-40蛋白表达量明显低于U87细胞（P＜0.05）,可见 SKOV-3细胞基本不表达 YK L-40蛋白。见表1和图1。

2.2 YKL-40过表达对SKOV-3细胞迁移影响YKL-40过表达组SKOV-3细胞迁移数明显高于对照组，比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2和图2。

表1 SKOV-3和U87细胞YKL-40蛋白表达比较（，n=6)

表1 SKOV-3和U87细胞YKL-40蛋白表达比较（，n=6)

细胞 YKL-40蛋白表达SKOV-3 U87 t P 0.004±0.001 0.986±0.032-75.132 ＜0.05

图1 Wetern blot检测图

表2 对照组和YKL-40过表达组细胞迁移数比较（，n=6)

表2 对照组和YKL-40过表达组细胞迁移数比较（，n=6)

分组 SKOV-3细胞迁移数（个）对照组YKL-40过表达组t P 104.39±20.03 270.31±25.60-12.503 ＜0.05

图2 细胞迁移图

2.3 YKL-40过表达抑制顺铂对SKOV-3细胞杀伤作用 在 1μg/L、2.5μg/L、5μg/L 顺铂下，YKL-40过表达组SKOV-3细胞抑制率明显低于对照组（P＜0.05），见表 3。

表3 不同顺铂作用下两组细胞抑制率比较（，n=6)

表3 不同顺铂作用下两组细胞抑制率比较（，n=6)

分组 1μg/L顺铂下细胞抑制率（%）对照组YKL-40过表达组2.5μg/L顺铂下细胞抑制率5μg/L顺铂下细胞抑制率t p 17.82±3.32 3.21±1.01 10.313＜0.05 30.03±3.50 17.20±2.78 7.031＜0.05 67.98±4.10 45.59±3.89 9.704＜0.05

3 讨论

基因突变、遗传及环境的交互作用等，均能够增加卵巢恶性肿瘤的发生风险。而现阶段临床上卵巢癌的总体治疗效果较为局限,包括卵巢癌根治性手术、卵巢癌肿瘤减灭术及术后放化疗等措施,虽然能够减轻卵巢肿瘤患者的高肿瘤负荷表现,改善患者短期内的临床症状,但其治疗后的病情缓解率水平或者远期的生存预后改善程度并不理想[6]。一项囊括了多中心的随机分析研究揭示了卵巢癌的治疗预后转归,发现卵巢癌的三年生存率不超过38%，同时无进展生存期不超过28个月[7]。而本次研究对于卵巢癌上皮性细胞株SKOV3的分析，具有下列几个方面的作用：⑴能够为卵巢癌上皮细胞的发病病因进行进一步的揭示和阐述，从而为卵巢癌的免疫靶向治疗提供作用靶点；⑵能够为卵巢癌静脉化疗耐药的机制进行分析，为提高卵巢癌的化疗敏感性提供依据。

YKL-40是重要的膜分泌型蛋白，其结构上具有多重重复的丝氨酸磷酸化结构，能够稳定结合细胞膜上的糖蛋白结构，激活细胞膜内侧的三磷酸成分，促进细胞内第二信使的上调，干预细胞内的信号传导机制。YKL-40蛋白能够在激活细胞内多种的肿瘤相关信号通路上发挥作用，提高MAPK及AKT信号通路的激活程度，提高细胞核内的转录基因的活性[8]；基础领域的研究还证实，YKL-40蛋白能够影响癌细胞的生物学特性，导致癌细胞对于淋巴结及血管内皮细胞的粘附能力的升高[9]；YKL-40还能够导致癌细胞异型性的改变，影响肿瘤组织的分级程度[10,11]。部分研究揭示了YKL-40在乳腺癌等恶性肿瘤中的表达情况，认为YKL-40的表达的上升是促进乳腺癌临床分期进展的风险因素[12]，但对于YKL-40与卵巢癌细胞SKOV3的关系研究较少。

在SKOV-3细胞中蛋白水平的分析可以发现，YKL-40蛋白的表达浓度较低，基本呈现出不表达的状态，YKL-40的表达浓度的下降提示了在上皮性肿瘤细胞中，SKOV3可能并不参与到卵巢癌的早期发生过程，其后期的YKL-40蛋白的表达异常可能与卵巢癌细胞在后续的增殖、分化障碍过程中的获得性表达有关。但鉴于本次研究采用的是人脑恶性胶质瘤细胞作为对照组，YKL-40蛋白的表达下降可能仅仅提示其表达浓度的相对性下降。在转染了YKL-40蛋白后，卵巢癌上皮细胞SKOV3的侵袭能力明显增强，提示了YKL-40蛋白对于卵巢癌细胞生物学特征的改变作用，荟萃国内外的相关基础领域的研究，笔者认为YKL-40对于卵巢癌细胞的侵袭能力的改变主要与下列因素有关[13]：⑴YKL-40能够提高卵巢癌细胞形成伪足的能力，导致癌细胞的变形能力及浸润能力的增加；⑵YKL-40能够促进卵巢癌上皮细胞间质成分的分解，降低癌细胞的细胞间粘附能力。刘炎等[14]研究者也发现，在卵巢癌浸润深度较深或者转移风险较高的人群中，卵巢癌肿瘤病灶组织中的 YKL-40表达浓度可平均上升27%以上，同时卵巢癌患者的临床分期越晚、治疗后的肿瘤复发率越高，YKL-40的表达浓度越高。卵巢癌的静脉化疗对于卵巢的治疗预后意义重大，化疗敏感性的下降能够显著增加肿瘤复发率和卵巢癌患者的病死率，导致患者临床转归的恶化，本次研究中顺铂作用后的卵巢癌细胞均存在明显的凋亡表现，但过度表达 YKL-40的卵巢癌上皮细胞SKOV3其细胞凋亡比例明显的下降，低于空白处理组SKOV3细胞，差异较为明显，提示了YKL-40蛋白对于卵巢癌细胞的凋亡具有一定的抑制作用，其能够降低SKOV3细胞的化疗敏感性，这可能主要与 YKL-40对于卵巢癌细胞对于顺铂药物的吸收速率的减慢、囊泡排泄化疗药物作用的增强等机制有关[15]。

综上所述，卵巢癌SKOV-3细胞不表达YKL-40蛋白,而YKL-40可增强SKOV-3细胞迁移能力，降低SKOV-3细胞铂类药物的敏感性，值得进一步研究。