干扰MDM4基因对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

张 靖，杨 茹，白惠娟

郑州大学附属肿瘤医院(河南省肿瘤医院)妇瘤科 郑州 450008

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，临床数据[1]显示，约80%的卵巢癌患者预后不良，表现出铂类耐药，导致化疗效果不理想。鼠双微体(murine doubleminute，MDM)4基因位于人类染色体1q32，其编码的蛋白质在结构上与MDM2蛋白高度同源[2]。多种恶性肿瘤的发生与MDM4基因异常表达密切相关[3]。研究[4]发现MDM4基因在肿瘤化疗耐药中同样发挥重要作用。Pellegrino等[5]的研究显示，MDM4通过介导PI3K/AKT途径参与肝细胞癌的发病和进展。还有研究[6-7]表明，PI3K/AKT途径的异常激活参与顺铂(DDP)耐药。本实验通过沉默MDM4在卵巢癌DDP耐药细胞A2780/DDP中的表达，观察细胞对DDP耐药性及PI3K/AKT信号通路的变化，为进一步阐明卵巢癌DDP耐药的分子机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1细胞及试剂卵巢癌细胞株SKOV3、A2780及其DDP耐药细胞株SKOV3/DDP、A2780/DDP均购自中国典型培养物保藏中心；DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；BCA蛋白检测试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；t-PI3K、p-PI3K、t-AKT、p-AKT、MDM4单抗及IgG二抗均购自美国CST公司；RNA提取试剂盒及反转录试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司；蛋白裂解液购自上海碧云天生物技术研究所；ECL化学发光检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Lipofectamine2000、MDM4 siRNA购自美国Invitrogen公司；MTT购自美国Sigma公司。

1.2细胞培养和转染SKOV3、A2780及SKOV3/DDP、A2780/DDP细胞均培养于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素的DMEM培养基中，置37 ℃、体积分数5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养，细胞贴壁生长至对数生长期，收集细胞用于后续实验。转染前1 d将A2780/DDP细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于6孔板中，密度为3×105个/孔，加入不含抗生素、含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养过夜，待细胞生长至40%融合时，将特异性沉默MDM4基因的重组载体质粒pLKO.1-puro-GFP-siRNA-MDM4及阴性对照pLKO.1-puro-GFP-siRNA-NC(上海钰博生物科技有限公司)转染至A2780/DDP细胞，分别记为MDM4 siRNA组和阴性对照组，将未转染质粒的A2780/DDP细胞记为空白对照组。每组均3个复孔。

1.3qRT-PCR检测细胞中MDM4mRNA表达水平分别收集对数生长期的SKOV3、A2780、SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞，用含0、10、20、40 μmol/L DDP的培养基培养48 h的A2780/DDP细胞，以及转染48 h后的3组A2780/DDP细胞，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，以分光光度计测定RNA浓度和纯度，参照反转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板进行扩增， 反应体系20 μL，其中模板0.8 μL、上下游引物各1 μL、2×SYBR Green PCR Mix 10 μL，以ddH2O补足20 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。MDM4上游引物：5’-ACGTTGGATGGA CAACTCAAGTCTAGACCC-3’；下游引物：5’-ACGT TGGATGTGTGTTACCTGTGGCAAGAC-3’。 内参GAPDH上游引物：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’；下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。采用2-ΔΔCt法计算MDM4 mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.4Western blot法检测细胞中MDM4、p-PI3K、t-PI3K、p-AKT和t-AKT蛋白表达水平分别收集对数生长期的SKOV3、A2780、SKOV3/DDP和A2780/DDP细胞，用含0、10、20、40 μmol/L DDP的培养基培养48 h的A2780/DDP细胞，以及转染48 h后的3组A2780/DDP细胞，加入蛋白裂解液，置冰上提取总蛋白。以BCA法检测蛋白浓度，将蛋白与加样缓冲液混匀，加热15 min使蛋白变性。取等量蛋白样品加入蛋白上样孔中，行SDS-PAGE电泳，电泳结束后电转至硝酸纤维素膜上，于含体积分数5%胎牛血清的封闭液中封闭1 h，加入相应的一抗，其中MDM4一抗1∶800稀释，p-PI3K、t-PI3K、p-AKT、t-AKT一抗均1∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次后加入1∶3 000稀释的二抗，室温下孵育1.5 h，TBST洗膜3次，加入ECL化学发光液，显影，采用Quantity One软件测定蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.5MTT法检测细胞生长抑制率及耐药性将3组A2780/DDP细胞用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，分别接种于96孔板中，密度为1×104个/孔，置37 ℃培养箱常规培养24 h，分别加入含0(对照)、10、20、40 μmol/L DDP的培养基，继续培养48 h后将培养基更换为正常培养基，24 h后每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，去上清液后，每孔加入二甲基亚砜溶液150 μL，置振荡仪上低速振荡反应10 min，在酶标仪上于490 nm波长处测定各孔吸光度(A)，计算细胞增殖抑制率，增殖抑制率=(1-实验孔A/对照孔A)×100%。绘制生存曲线，计算DDP对各组细胞的IC50。实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0进行数据分析。不同组间MDM4 mRNA和蛋白相对表达量，细胞增殖抑制率，p-PI3K、t-PI3K、p-AKT和t-AKT蛋白相对表达量的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同卵巢癌细胞中MDM4表达的比较SKOV3、A2780和SKOV3/DDP、A2780/DDP中MDM4的表达水平见图1和表1。可知，与卵巢癌细胞相比，卵巢癌DDP耐药细胞中MDM4 mRNA和蛋白表达水平升高，MDM4在A2780/DDP细胞中表达水平最高，故后续选择A2780/DDP细胞进行实验。

1：SKOV3；2：SKOV3/DDP；3：A2780；4：A2780/DDP

细胞nMDM4 mRNAMDM4蛋白SKOV331.00±0.090.26±0.03SKOV3/DDP33.22±0.31∗0.47±0.05∗A278031.36±0.200.21±0.02A2780/DDP34.62±0.41∗#△0.67±0.08∗#△F109.54152.343P<0.001<0.001

*：与SKOV3细胞比较，P<0.05；#：与A2780细胞比较，P<0.05；△：与SKOV3/DDP细胞比较，P<0.05

2.2不同剂量DDP作用后A2780/DDP细胞中MDM4表达的比较结果见图2和表2。随着DDP剂量的升高，A2780/DDP细胞中MDM4 mRNA和蛋白表达水平逐渐降低。

2.3沉默MDM4对A2780/DDP细胞中MDM4表达的影响结果见图3和表3。MDM4 siRNA组细胞中MDM4 mRNA和蛋白表达水平均低于空白对照组和阴性对照组。

1：0 μmol/L DDP；2：10 μmol/L DDP；3：20 μmol/L DDP；4：40 μmol/L DDP

图2不同剂量DDP作用后A2780/DDP细胞中MDM4蛋白的表达

表2 不同剂量DDP作用后A2780/DDP细胞中MDM4 mRNA和蛋白表达的比较

*：组间两两比较，P均<0.05

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：MDM4 siRNA组

组别nMDM4 mRNAMDM4蛋白空白对照组31.01±0.100.68±0.07阴性对照组30.98±0.090.65±0.07MDM4 siRNA组30.22±0.03∗#0.16±0.02∗#F94.94275.206P<0.001<0.001

*：与空白对照组比较，P<0.05；#：与阴性对照组比较，P<0.05

2.4沉默MDM4对A2780/DDP细胞DDP耐药性的影响结果见表4。不同剂量DDP作用后，MDM4 siRNA组细胞增殖抑制率均高于其他两组。MDM4 siRNA组的IC50为(10.19±1.62) μmol/L，低于空白对照组的(29.20±3.53) μmol/L和阴性对照组的(25.92±3.28) μmol/L(F=107.882，P<0.001)。

表4 不同剂量DDP作用后各组A2780/DDP细胞增殖抑制率的比较 %

*：与空白对照组比较，P<0.05；#：与阴性对照组比较，P<0.05

2.5沉默MDM4对A2780/DDP细胞PI3K/AKT信号通路的影响结果见图4和表5。MDM4 siRNA组中p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平均低于其他两组。

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：MDM4 siRNA组

组别np-PI3Kt-PI3Kp-AKTt-AKT空白对照组30.15±0.021.21±0.150.18±0.020.87±0.08阴性对照组30.14±0.021.18±0.110.16±0.020.90±0.09MDM4 siRNA组30.02±0.01∗#1.25±0.160.03±0.01∗#0.92±0.11F52.3330.18466.3330.214P<0.0010.836<0.0010.813

*：与空白对照组比较，P<0.05；#：与阴性对照组比较，P<0.05

3 讨论

卵巢癌是一种发病率和病死率较高的妇科恶性肿瘤，晚期卵巢癌患者5 a生存率低于40%[8]。目前治疗晚期卵巢癌的主要方法是以铂类药物为基础的化疗，但多数患者对铂类化疗药物易产生耐药性，严重影响了化疗效果。MDM4基因在多种恶性肿瘤中呈高表达，参与肿瘤的发生发展[9]。该研究结果显示，MDM4在卵巢癌DDP耐药细胞株的表达水平明显升高；以不同剂量DDP干预A2780/DDP细胞，结果显示DDP干预后细胞中MDM4表达水平明显降低。将MDM4 siRNA转染到A2780/DDP细胞中，结果显示，沉默MDM4表达后A2780/DDP细胞增殖抑制率升高，DDP对A2780/DDP细胞的IC50降低，提示沉默MDM4基因能够降低A2780/DDP细胞对DDP的耐药性。Wang等[10]研究发现，miR-1307通过靶向MDM4调节细胞凋亡参与乳腺癌DDP耐药的发展。还有研究[11]显示，在DDP耐药的2780CP/Cl-16卵巢癌细胞中，p53(V172F)突变可促进MDM4募集，从而诱导DDP抗性。

PI3K/AKT信号通路与肿瘤化疗耐药密切相关。研究[12]显示，PI3K/AKT信号通路的活化与DDP、阿霉素等化疗药物的耐药密切相关。Yan等[13]发现，lncRNA HOTAIR通过靶向miR-126激活PI3K/AKT信号通路，促进胃癌DDP耐药。目前研究[14]已证实，PI3K/AKT信号通路的过度活化参与卵巢癌细胞DDP耐药性，抑制该通路能够明显降低DDP耐药性。AKT是PI3K/AKT信号通路的关键效应分子，p-AKT可激活下游靶基因表达，进而发挥生物学效应。本研究中发现，沉默MDM4后A2780/DDP细胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平显著下调，提示沉默MDM4能够抑制PI3K/AKT信号通路的激活。因此推测，沉默MDM4基因的表达可通过抑制PI3K/AKT信号通路而降低A2780/DDP细胞对DDP的耐药性。

总之，MDM4基因参与卵巢癌细胞对DDP耐药性，其作用机制可能与提高PI3K/AKT信号通路的活化水平有关。