上调睾丸特异性Y样蛋白5的表达对LoVo细胞侵袭、迁移及STAT3蛋白表达的影响

付 强，张金岱，谢建国

河南省肿瘤医院(郑州大学附属肿瘤医院)普外科 郑州 450008

结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，随着我国人口老龄化及其他致癌因素的增加，结直肠癌的发病率呈上升趋势，严重威胁人们的生命健康[1]。肿瘤的侵袭及转移是引起结直肠癌患者复发死亡的一个主要原因。上皮细胞间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞在特定生理病理条件下向间质细胞转化的现象;已证实EMT与肿瘤侵袭、转移密切相关，是决定肿瘤侵袭和转移程度的一个关键因素[2]。多项研究[3-4]也表明，抑制EMT可降低结直肠癌细胞的侵袭及迁移能力。睾丸特异性Y样蛋白5(testis-specific Y-encoded-like protein 5，TSPYL5)是新发现的一种抑癌基因，属于TSPYL家族成员之一，定位于常染色体8q22.1，在人体正常组织表达广泛，而在肿瘤组织中表达下调[5]。有研究[6]表明，结肠癌组织中TSPYL5的表达低于癌旁正常黏膜，且其表达随TNM分期及浸润深度的增加而下调。STAT3是信号转导与转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)家族成员之一，在多种肿瘤中异常活化，被称为癌基因，异常活化的STAT3信号通路可通过调控EMT促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力[7]。本研究旨在观察上调TSPYL5的表达对结直肠癌LoVo细胞侵袭与迁移能力的影响，并进一步研究其对EMT相关蛋白及STAT3蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料人结直肠癌LoVo细胞购自中科院上海细胞生物研究所细胞库。胎牛血清、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，TSPYL5、E-cadherin、Vimentin、STAT3和p-STAT3抗体及HRP标记的羊抗鼠IgG均购自美国CST公司，Transwell小室购自美国Corning Costar公司，BCA试剂盒购自美国Thermo公司，STAT3信号通路抑制剂AG490购自美国Sigma公司，凝胶成像系统购自美国ProteinSimple公司。

1.2细胞培养LoVo细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在体积分数5%CO2、饱和湿度、37 ℃恒温培养箱中培养。每隔2 d换液一次，细胞达70%～85%密度时用胰蛋白酶消化后传代。实验取处于对数生长期的细胞。

1.3细胞分组LoVo细胞分为空白1组、空载体组(转染pcDNA3.1质粒)和TSPYL5质粒组(转染pcDNA3.1-TSPYL5重组质粒，上海生工生物工程股份有限公司设计合成)。以2×105个/孔密度接种LoVo细胞于6孔板，于培养箱内常规培养，待细胞贴壁生长达70%融合时进行转染，转染参照Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)说明，依据预实验结果，每孔转染质粒4 μg，于转染48 h收集细胞，用于后续实验。

1.4细胞侵袭能力检测将120 μL的Matrigel胶(用2倍体积的无血清RPMI 1640稀释)铺在Transwell小室上室中，37 ℃、30 min后待胶凝固，将3组细胞密度调整为1×106个/mL，上室中每孔加入200 μL细胞悬液(约1×105个/孔)，下室中加入500 μL含体积分数10%胎牛血清的培养液，37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中常规培养，24 h后取出Transwell小室，吸弃上室液体，棉签轻轻拭掉Matrigel胶及未侵袭的细胞，PBS漂洗，甲醛固定，苏木精染色，倒置显微镜选取5个视野(×400)，计数穿膜细胞，取均值。实验重复3次。

1.5细胞迁移能力检测除Transwell小室上室未铺Matrigel胶，其他操作同细胞侵袭能力检测。实验重复3次。

1.6TSPYL5、EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin)、STAT3和p-STAT3蛋白表达的检测用RIPA裂解液提取上述3组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品煮沸变性5 min，低速离心30 s，加入适量4×SDS，每孔上样40 μg，经10 g/L SDS-PAGE分离后电转移至PVDF膜，用含50 g/L脱脂奶粉的TBST在37 ℃下封闭1 h，加1∶500稀释的TSPYL5、E-cadherin、Vimentin、STAT3和p-STAT3及1∶1 000稀释的GAPDH抗体(内参)，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗5 min×3次，加1∶4 000稀释的HRP标记的二抗，37 ℃孵育45 min。TBST漂洗5 min×3次，ECL化学发光法显影。用Image J软件分析条带灰度值。以目的条带与GAPDH条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.7抑制STAT3蛋白后细胞侵袭与迁移能力以及E-cadherin和Vimentin蛋白表达检测取LoVo细胞，分为空白2组、AG490组(加50 μmol/L AG490)和AG490+TSPYL5质粒组(50 μmol/L的AG490及pcDNA3.1-TSPYL5转染)。处理48 h后，参照1.4和1.5方法检测细胞侵袭及迁移能力，参照1.6方法检测E-cadherin和Vimentin蛋白的表达。

1.8统计学处理采用SPSS 21.0处理数据，采用单因素方差分析比较各组细胞以上指标的差异，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1空白1组、空载体组和TSPYL5质粒组细胞TSPYL5蛋白表达及侵袭、迁移能力的比较结果见图1、表1。与空白1组和空载体组比较，TSPYL5质粒组细胞TSPYL5蛋白表达水平升高，侵袭和迁移能力降低。

1～3：分别为空白1组、空载体组和TSPYL5质粒组

组别TSPYL5蛋白 侵袭细胞数迁移细胞数空白1组0.041±0.008187.8±10.9142.6±7.7空载体组0.036±0.007184.9±9.2140.2±6.8TSPYL5质粒组0.368±0.042∗98.3±5.7∗85.1±5.1∗F173.55798.65872.389P<0.001<0.001<0.001

*：与空白1组和空载体组比较，P<0.05

2.2空白1组、空载体组和TSPYL5质粒组细胞EMT相关蛋白及STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的比较结果见图2、3和表2。与空白1组和空载体组比较，TSPYL5质粒组E-cadherin蛋白表达水平升高，Vimentin和p-STAT3蛋白表达水平降低。

1～3：分别为空白1组、空载体组和转染TSPYL5质粒组

1～3：分别为空白1组、空载体组和转染TSPYL5质粒组

组别E-cadherinVimentinSTAT3p-STAT3空白1组0.132±0.0120.311±0.0280.669±0.0720.147±0.016空载体组0.143±0.0140.337±0.0340.678±0.0750.159±0.018TSPYL5质粒组0.567±0.056∗0.158±0.016∗0.685±0.0740.029±0.006∗F159.28738.3370.03675.409P<0.001<0.0010.965<0.001

*：与空白1组和空载体组比较，P<0.05

2.3空白2组、AG490组及AG490+TSPYL5质粒组细胞侵袭、迁移能力及EMT相关蛋白表达的比较结果见表3。AG490组细胞侵袭及迁移能力均低于空白2组，而AG490+TSPYL5质粒组细胞侵袭及迁移能力均低于AG490组；AG490组E-cadherin蛋白的表达高于空白2组，Vimentin蛋白的表达低于空白2组，而AG490+TSPYL5质粒组E-cadherin蛋白的表达高于AG490组，Vimentin蛋白表达低于AG490组。

表3 3组细胞侵袭、迁移能力及EMT相关蛋白表达的比较(n=3)

*：与空白2组比较，P<0.05；#：与AG490组比较，P<0.05

3 讨论

肿瘤的发生发展是一个复杂的病理过程，涉及抑癌基因失活、癌基因过度表达、DNA错配修复的功能缺失等[8]。其中抑癌基因表达下调或失活被认为是肿瘤发生的早期事件[9]。TSPYL5属于TSPYL家族，是新发现的一种抑癌基因，参与染色质构成、各种细胞活动，同时也可能与调节基因表达有关[10]。目前TSPYL5的分子生物学功能及分子机制仍不明确。有研究[11-13]表明，胃癌中TSPYL5表达下调，上调其表达可抑制细胞生长;TSPYL5在结直肠癌低表达，过表达TSPYL5可抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移和诱导凋亡;而肺腺癌A549细胞中TSPYL5表达上调，抑制其表达可抑制细胞生长。本研究结果表明，上调TSPYL5表达后，结直肠癌LoVo细胞侵袭和迁移能力降低，与文献[12]报道一致。

EMT主要表现为E-cadherin和角蛋白等上皮标志物表达缺失或降低，Vimentin和神经钙黏蛋白等间质性标志物表达增加，同时细胞形态向成纤维细胞等间质细胞样转变，进而获得侵袭和迁移能力[14]。有研究[15-16]显示，致癌基因FOXK1通过诱导EMT促进结直肠癌细胞的侵袭转移；二苯乙烯苷通过PI3K/AKT通路抑制TGF-β诱导的结直肠癌EMT，并降低其运动迁移能力。本研究结果显示，上调TSPYL5表达可抑制LoVo细胞Vimentin表达，促进E-cadherin表达，提示上调TSPYL5可通过逆转EMT抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移。

许多信号通路可诱导EMT的产生，如活化的Wnt信号、NF-κB信号、Notch信号、STAT3信号通路等[17]。STAT3是STATs家族成员之一，与细胞增殖、凋亡、侵袭、转移等密切相关，多种肿瘤中STAT3信号通路异常激活，活化的STAT3可转录激活下游的靶基因，进一步引起一系列相关因子的激活和蛋白表达，从而促进肿瘤发生、侵袭和转移，因此STAT3被称为癌基因[18-19]。研究[20]表明，抑制STAT3信号可阻碍肿瘤发生发展，因此抑制STAT3信号已成为肿瘤治疗热点。本研究结果显示，上调TSPYL5表达可抑制p-STAT3表达，提示上调TSPYL5表达可抑制STAT3信号。AG490为JAK2特异性抑制剂，可抑制STAT3信号，本研究进一步探究抑制STAT3信号对结直肠癌细胞侵袭和迁移的影响，结果显示，在应用AG490的基础上，上调TSPYL5表达可进一步抑制LoVo细胞侵袭和迁移能力，促进E-cadherin的表达，抑制Vimentin的表达，提示上调TSPYL5表达可能通过逆转EMT，从而抑制结直肠癌细胞侵袭和迁移能力。

综上所述，上调TSPYL5的表达可能通过抑制STAT3信号逆转EMT，进而降低结直肠癌细胞侵袭和迁移能力。后续研究将致力于TSPYL5对结直肠癌细胞其他生物学特性、机制的研究及体内研究，为结直肠癌的诊疗提供理论依据。