NF1和p-ERK1/2蛋白在苯并芘联合脂多糖诱导的小鼠肺癌中的表达

邵 华，张 怡，黄 丽，高 敏，冯斐斐

郑州大学公共卫生学院卫生毒理学教研室 郑州 450001

肺癌已成为世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，由于当前肺癌的早期诊断率和远期疗效仍不够理想，故对肺癌的诊治手段还需做更多的研究和探索[1]。有研究[2]表明，神经纤维瘤蛋白1(neurofibromatosis 1,NF1)可以将活性的RAS-GTP复合物转换为非活性的RAS-GDP，NF1表达水平的降低导致RAS信号通路的持续激活，进而刺激细胞生长、增殖。此外NF1缺失还可激活以RAS和细胞外信号调节激酶(ERK)活性增加为特征的旁路途径[3]。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路的一个重要因子，能够被多种刺激因子激活，引起多种内在调控基因的表达，从而导致细胞恶性增殖和转化。谭婧瑾[4]研究发现，非小细胞肺癌患者肺组织中磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织。此外，有研究[5]表明炎症与多种恶性肿瘤的发生有关，并且已有研究证实脂多糖(LPS)能够加速4-(甲基亚硝氨基)-3-吡啶-1-丁酮[4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone,NNK)]诱导的小鼠肺部肿瘤的发生[6]。故本实验采用苯并芘[B(a)P][7]替代NNK联合LPS染毒，构造小鼠炎症促癌模型，探讨NF1和p-ERK1/2蛋白表达与炎性相关肺癌的关系，从而为其防治提供作用靶点。

1 材料与方法

1.1实验动物来源SPF级C57BL/6小鼠，雌雄各半，体重20～30 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，常规饲养于郑州大学公共卫生学院动物房，自由饮水和进食，饲养温度为18～22 ℃，昼夜节律同自然。

1.2实验分组采用随机数字表法将实验动物分为4组：B(a)P联合LPS组[B(a)P+LPS组，n=35)、单独B(a)P组[B(a)P组，n=35]、单独LPS组(LPS组，n=15)和三辛酸甘油酯联合生理盐水组[对照组，n=15]。B(a)P+LPS组小鼠经异氟烷麻醉后气管内滴注B(a)p悬浮液，染毒剂量为1 mg/只(溶于50 μL三辛酸甘油酯)，每周1次，连续4周后停止，B(a)p染毒结束后记为第0周，第3周进行LPS气管内滴注，染毒剂量为2.5 μg/只(溶于50 μL生理盐水)，每3周1次，给予5次后停止。B(a)p组小鼠气管内滴注1 mg/只的B(a)p悬浮液，每周1次，连续4周。LPS组每只小鼠气管内滴注2.5 μg/只LPS溶液，每3周1次，连续给予5次。对照组小鼠气管内滴注等体积的三辛酸甘油酯和无菌生理盐水。

1.3观察指标及方法染毒结束后，小鼠正常饲养，30周后对小鼠进行解剖，肉眼观察小鼠肺部出现肿瘤的数量和出现肺癌的小鼠数，计算肺癌发生率和各组小鼠平均肿瘤形成数。取左侧肺叶固定在40 g/L多聚甲醛中，石蜡包埋，检测肺部相关蛋白的表达。

1.4肺癌组织中NF1、p-ERK1/2蛋白表达的免疫组化检测肺组织切片经脱蜡水化、抗原修复、灭活内源性过氧化物酶后，用山羊血清室温封闭30 min，滴加兔抗小鼠NF1和p-ERK1/2(均按1∶100稀释)4 ℃孵育过夜，然后滴加山羊抗兔二抗室温孵育50 min，最后经DAB显色和苏木素复染后脱水封片。以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。山羊抗兔二抗、兔抗小鼠p-ERK1/2抗体和兔抗小鼠NF1抗体购自北京博奥森生物技术公司；SP双标记染色试剂盒和DAB显色剂购自武汉谷歌生物技术有限公司。结果判定：NF1和p-ERK1/2蛋白以着色呈浅黄色至棕褐色为阳性细胞。采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件测量3个视野(×200)下阳性区域面积和累积光密度，通过公式(平均光密度=累积光密度/阳性表达区域面积)计算并分析数据[8]。

1.5统计学处理采用SPSS 21.0对数据进行分析。应用χ2检验比较各组小鼠肺部成瘤率，采用非参数秩和检验比较各组小鼠平均肿瘤形成数，应用完全随机设计的方差分析和Bonferroni检验比较各组小鼠肿瘤组织中NF1蛋白和p-ERK1/2蛋白表达的差异。应用Pearson相关分析各组肺组织中NF1和p-ERK1/2蛋白表达的相关性，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组小鼠肺部成瘤情况对照组与LPS组小鼠未形成肿瘤；B(a)p+LPS组小鼠肿瘤形成率(96.97%)高于B(a)p组(82.05%)(χ2=4.028，P=0.045)；B(a)p+LPS组小鼠的平均肿瘤形成数[10.0(4.0,19.2)]高于B(a)p组[3.0(1.0,6.0)](Z=3.762，P<0.001)。

2.2各组小鼠肺癌组织中NF1和p-ERK1/2蛋白的表达见图1、2和表1。NF1蛋白主要表达于细胞核，在癌巢部位多呈低表达或不表达，在正常组织中明显表达；p-ERK1/2蛋白主要表达于细胞质，在癌巢部位多呈高表达状态，在正常组织中散在分布。

2.3各组小鼠肺癌组织中NF1和p-ERK1/2蛋白表达的相关性见表2。B(a)p+LPS组两者的Pearson相关系数为-0.771(P<0.05)，其他3组两蛋白表达无相关性。

A：肺泡；B：细支气管；1：对照组；2：LPS组；3：B(a)p组；4：B(a)p+LPS组

A：肺泡；B：细支气管；1：对照组；2：LPS组；3：B(a)p组；4：B(a)p+LPS组

表1 各组小鼠肺癌组织中NF1和p-ERK1/2蛋白表达的比较

*：与对照组相比，P<0.05；#：与B(a)p组相比，P<0.05

表2 各组小鼠肺癌组织中NF1和p-ERK1/2蛋白表达的相关性分析

3 讨论

肿瘤的发生、进展受肿瘤微环境调控，慢性炎症在肿瘤发生过程中发挥着极其重要的作用[9]。肿瘤微环境中炎性细胞和因子的长期存在可以促进肿瘤细胞的生长，抑制凋亡。研究[10]发现LPS作为一种内毒素能够诱导炎症反应，通过改变肿瘤微环境而参与癌症的发生发展。本研究结果显示，单独LPS作用并不诱发肺癌，单独B(a)p可诱导肺癌发生；而与B(a)p组相比，B(a)p+LPS组小鼠的肿瘤形成率升高、小鼠的平均肿瘤形成数明显增加，提示LPS确实可以通过介导炎症加重B(a)p诱导的肺癌的形成。

NF1基因已被确认为抑癌基因，其突变、缺失与肿瘤的发生、进展、疾病的疗效、预后，甚至和某些肿瘤的不良抵抗有关[11]。杜珊等[12]在一项胃癌研究中发现NF1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率低于正常胃组织，NF1蛋白高表达组的生存率高于低表达组。另外，张鹏[13]在对未分化多形性肉瘤(UPS)的研究中发现瘤组织中NF1蛋白表达阳性率低于瘤旁正常肌肉组织。本实验结果显示NF1蛋白在肺部正常组织中明显表达，而在癌组织中多呈低表达或不表达；与对照组相比，B(a)p+LPS和B(a)p组NF1蛋白表达降低，提示NF1可能具有抑癌基因的功能，与以往的研究结果一致。B(a)p+LPS组NF1蛋白表达水平与B(a)p组相比亦明显降低，表明炎症的存在能够使肺癌加重。

NF1基因缺失会引起Ras超活化，随后导致Raf/MEK/ERK信号通路的激活。 ERK是MAPKs家族的重要成员之一，在丝裂原受相应信号刺激后，ERK接受上游的级联反应信号转化为p-ERK进入细胞核，活化细胞核内的某些转录因子，进而参与细胞的调控及增殖[14-15]。王西洁[16]通过免疫组化法检测发现TNMⅢ～Ⅳ期肺癌组织中p-ERK蛋白表达高于Ⅰ～Ⅱ期，并且高于正常肺组织。本研究结果显示，p-ERK1/2蛋白在肺癌组织中高表达，在正常组织中低表达且散在分布；与对照组相比，B(a)p+LPS和B(a)p组的p-ERK1/2蛋白表达增加，这与上述研究结果一致。

为了探究肺癌组织中NF1和p-ERK1/2蛋白表达之间的关系，本研究进行了相关分析，结果表明NF1与p-ERK1/2蛋白的表达呈负相关，这证实NF1作为RAS蛋白的负调节因子，其表达产物减少使RAS通路不断激活，进而使下游的ERK磷酸化水平升高[17]。然而B(a)p+LPS组与B(a)p组相比以及LPS组与对照组相比p-ERK1/2蛋白的表达均无统计学意义，其原因可能是除了NF1低表达导致RAS-ERK通路的持续激活外，还可能有其他的因子参与ERK的调控，如蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)对ERK通路的活化。

综上所述，NF1蛋白在肺癌组织中低表达，p-ERK1/2蛋白呈高表达，两者表达呈负相关，提示NF1作为一种抑癌基因其正常表达可抑制肺癌的发生发展；低表达时RAS下游的RAF/MEK/ERK通路持续激活，从而使p-ERK1/2蛋白表达水平升高，细胞发生癌变和增殖。探索NF1和p-ERK1/2蛋白在肺癌中的表达情况，有助于对肺癌发病机制进行更深了解，开辟肿瘤治疗新途径。