猪流行性腹泻病毒IgA抗体间接ELISA方法的建立

刘 烨，张家林，王潇博，石 达，时洪艳，陈建飞，张 鑫，冯 力

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由PED 病毒(PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，主要侵害初生仔猪，引起仔猪水样腹泻、呕吐、脱水等症状，临床剖检常见猪的空肠、回肠的肠绒毛萎缩和脱落[1-2]。目前，PEDV 在各地仍然广泛流行，能够感染各个年龄阶段的猪，引起大量仔猪腹泻和死亡，造成养猪业严重的经济损失[3]。因此，建立特异有效的检测PEDV 的方法对于该病的防控具有重要的意义。

PEDV 属于冠状病毒科冠状病毒属，编码4 个主要的结构蛋白，包括纤突蛋白S、囊膜蛋白E、膜蛋白M 和核衣壳蛋白N。S 蛋白是一种糖蛋白，位于病毒粒子表面，分为 S1(aa1 ～aa735)和 S2(aa736～aa1383)两个结构域，分别在病毒吸附和侵入宿主细胞的过程中发挥着重要的作用，其中S1蛋白具有多个中和表位，是诱导机体产生针对病毒特异性中和抗体的重要靶蛋白[4-8]。文献报道PEDV自然感染能够诱导母猪产生针对S 蛋白的特异性IgG 和IgA 抗体，并且持续时间长达6 个月[9-11]；基于PEDV S1 蛋白的重组疫苗能够诱导机体产生较高水平的IgG 和IgA 抗体，同时免疫保护作用与两种抗体水平的变化具有相关性[12-13]。根据S 基因的不同将PEDV 分为G1 型和G2 型，G2 型为世界范围内广泛流行[3,14]。本实验室分离到一株G2 型PEDV，命名为LNct2a 株(KT323980)，基于该株病毒的S1蛋白建立检测PEDV 特异性抗体的间接ELISA 方法，为及时检测PEDV 的流行情况并监测疫苗的免疫效力提供良好的技术手段。

PEDV 感染主要侵害仔猪的小肠上皮细胞，肠道局部黏膜免疫发挥着重要的抗病毒作用[15]，其中PEDV 特异性IgA 抗体在血清中的变化与肠相关淋巴组织中的抗体分泌细胞(Antibody-secreting cells，ASC)的应答有关，能够用于评价PEDV 感染情况和疫苗免疫的应答水平。与原核表达相比，真核表达能够完成对蛋白翻译后的修饰，包括折叠、糖基化、磷酸化及酰基化等等，这样获得的蛋白结构更接近于天然构象，生物学活性更高[16]。研究表明，人源IgG Fc 片段能够促进重组蛋白在真核细胞中的分泌表达[17]。因此，本研究构建真核表达质粒并转染293T 细胞，高效地融合表达S1 蛋白和Fc 片段，随后以纯化的S1 蛋白作为包被抗原，以羊抗猪IgAHRP 作为二抗，对各反应条件优化后，建立检测PEDV G2 型特异性 IgA 抗体的间接ELISA 检测方法，为临床监测猪血清中IgA 抗体水平及疫苗免疫效果的评价提供有效检测手段。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料PEDV LNct2a 株为本实验室前期分离保存。PEDV S1 蛋白真核表达的优化片段、人源IgG Fc 片段、大肠杆菌(E.coli)DH5α 感受态细胞、293T 细胞和pAAV-IRES-hrGFP 重组表达质粒均由本实验室保存；protein-G 亲和层析柱购自GE 公司；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、2× PrimeSTAR Max Premix，购自美国NEB 公司；转染试剂(Attractene Transfection Reagent)购自德国 Qiagen 公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自TaKaRa 公司；鼠抗S1 蛋白单克隆抗体(MAb)S5F7 由本实验室制备；羊抗猪IgA-HRP 和羊抗鼠IgG-DY800 购自Abcam 公司；TMB 底物显色液购自Amresco 公司；PEDV、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒(PCV2)阴、阳性血清由本实验室制备；142 份临床血清样品来自黑龙江、河南、山东等地猪场，由本实验室收集保存。

1.2 重组真核表达质粒的构建及蛋白的表达纯化

1.2.1 引物设计 由华大基因优化LNct2a 株S1 基因，利用Oligo 7.0 软件针对PEDV LNct2a 株的S1基因(KT323980)设计1 对引物LNCT-optiS1-F：ATA TGCAGAATTCATGAAGTCCCTGACCTACTTC(EcoRⅠ)/LNCT-optiS1-R：CAGCATGAGCATCCGGACCG ACAAAACTCACACATGCCCA；针对人源 Fc 片段(KY053479.1)设计一对引物：LNCT optiS1 Fc-F：TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGTCCGGATGCTC ATGCTG/LNCT/optiS1 Fc-R：TATATAAACTCGAGT TATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCT (XhoⅠ )。引物由吉林库美公司合成。

1.2.2 重组真核表达质粒的构建 以优化的LNct2a株S1 基因为模板，LNCT-optiS1-F/LNCT-optiS1-R 为引物，PCR 扩增S1 片段；以人源IgG 分子的Fc 基因片段为模板，LNCT optiS1 Fc-F/LNCT optiS1 Fc-R为引物，PCR 扩增Fc 片段。反应程序：98 ℃ 10 s；55 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，35 个循环；4 ℃ 10 min。将PCR 产物经1 %琼脂糖凝胶电泳回收两个目的片段，采用引物LNCT-optiS1-F/LNCT optiS1 Fc-R 进行融合PCR。PCR 产物命名为LNCT2-S1-Fc，胶回收目的片段。使用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP 和目的片段LNCT2-S1-Fc分别双酶切后连接，构建的重组质粒将经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序鉴定，正确的重组质粒命名为pAAV-LNCT2-S1-Fc。

1.2.3 重组蛋白的表达、纯化及鉴定 利用转染试剂将重组质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc 转染293T 细胞，利用倒置荧光显微镜观察GFP 蛋白的绿色荧光后，收集上清，采用Protein G 树脂及AKATA 纯化仪器纯化融合蛋白，并命名为PEDV-LNCT2-S1-Fc，经BCA 蛋白定量试剂盒测定该融合蛋白的浓度。将纯化的蛋白经 SDS-PAGE 电泳后，以鼠抗 S1 蛋白MAb S5F7 (1∶500)作为一抗，以羊抗鼠IgG-DY800(1∶15 000)作为二抗，利用Odyssey 红外荧光扫描成像系统进行扫描，对S1 蛋白进行western blot 鉴定和分析。

1.3 间接ELISA 方法的建立及反应条件的优化采用方阵滴定法，确定间接ELISA 的S1 蛋白最佳抗原包被浓度 (6 μg/mL、 3 μg/mL、 1.5 μg/mL、0.75 μg/mL、0.325 μg/mL)，最佳血清稀释度(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400)，羊抗猪 IgA-HRP 二抗最佳稀释度(1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000)，最佳孵育时间(30 min、45 min、60 min)，TMB 底物显色液的最佳显色时间(5 min、10 min、15 min)，建立检测血清IgA 抗体的间接ELISA 方法。

1.4 临界值的确定利用IFA 方法从实验室保存的猪血清中筛选出90 份阴性血清，按优化后的间接ELISA 方法检测该阴性血清，并设立阴性对照和阳性对照。将每份血清经间接ELISA 检测得到的OD450nm值转换为样品百分反应活性(Percent reactivity，PR)，即(待检血清 OD450nm值- 阴性血清 OD450nm值)/(阳性血清 OD450nm值 - 阴性血清 OD450nm值)，计算PR 值的平均值()和标准方差(SD)。当样品PR值 ＜+2SD 时，判为阴性；当样品 PR 值 ＞时，判为阳性；介于二者之间，判为疑似，需二次检测，如果PR 值仍小于时则判为阴性。

1.5 特异性试验利用建立的间接ELISA 方法对本实验室制备的TGEV、PDCoV、PoRV 和PCV2 阳性血清进行检测，并设立PEDV 阳性、阴性血清对照，每份样品设3 个重复。评估该ELISA 方法的特异性。

1.6 敏感性试验将PEDV 阳性血清经2 倍倍比稀释(1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600)后，按已建立的IgA 抗体的间接ELISA 方法操作，评估该ELISA 方法的敏感性。

1.7 重复性试验按本研究建立的IgA 抗体间接ELISA 方法操作，使用同批次包被的ELISA 板，对阳性、弱阳性和阴性血清各2 份，共6 份血清，每份血清重复6 孔，进行批内重复性试验；以不同批次包被的ELISA 板，对该6 份血清进行批间重复性试验，评估该方法的重复性。

1.8 临床样品的检测利用本试验建立的间接ELISA 方法与文献中报道的金标准IFA 方法[18]对来源于黑龙江、河南、山东等地142 份猪血清进行检测。比较两种方法的检测结果，并计算二者的符合率。

2 结 果

2.1 重组质粒的鉴定重组质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc 用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定(S1 基因片段与Fc 基因片段分别为2 382 bp 和681 bp，融合片段约为3 000 bp)，结果显示，在约3 000 bp 和6 200 bp处分别有两条目的片段，与预期结果一致(图1)。测序结果显示重组质粒无碱基缺失、突变，与目的片段序列一致。表明重组质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc 正确构建。

图1 重组质粒的双酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pAAV-LNCT2-S1-Fc by double enzyme digestions

2.2 重组蛋白的SDS-PAGE 检测和western blot鉴定将重组质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc 转染293T 细胞，收集细胞的培养液上清，利用亲和层析柱纯化蛋白，经BCA 蛋白定量试剂盒测定PEDV-LNCT2-S1-Fc 融合蛋白的浓度为6.25 μg/mL。将该融合蛋白进行SDS-PAGE 检测和western blot 鉴定(利用The Sequence Manipulation Suite 软件在线预测S1 蛋白和Fc 蛋白大小分别约为87 ku 和26 ku)。结果显示在150 ku 处有目的条带，与预期融合的S1 蛋白和Fc蛋白大小基本相符(真核表达的蛋白由于翻译后的修饰使蛋白实际大小大于预期结果)(图2A、2B)。结果表明，目的融合蛋白以分泌的形式表达，蛋白纯化效果较好，且具有较好的反应原性。

图2 重组融合蛋白的SDS-PAGE(A)及western blot(B)鉴定Fig.2 SDS-PAGE (A)and western blot(B)analysis of recombinant protein PEDV-LNCT2-S1-Fc

2.3 间接ELISA 方法的建立及反应条件的确定经优化，该方法的最佳反应条件见表1。

2.4 间接ELISA 临界值的确定应用本研究优化的ELISA 方法检测90 份PEDV 阴性血清样品。结果显示，检测数据经计算平均值为8.8，标准方差SD 为 5.9，阴性临界值+2SD 为20.6，阳性临界值+3SD 为 26.5 (图3)。当 PR 值大于 26.5，判定样品为阳性；当PR 值小于20.6，判定为阴性；当PR 值介于20.6 和26.5 之间的样品则判为疑似，若重复之后结果仍低于26.5 则判定为阴性。

表1 间接ELISA 检测方法反应条件优化结果Table 1 The optimized conditions of indirect ELISA

图3 临界值的确定Fig.3 The cut-off value determination

2.5 特异性试验结果利用建立的间接ELISA 方法对TGEV、PDCoV、PoRV 和PCV2 的阳性血清进行检测，结果显示PR 值均低于26.5，该方法的包被抗原S1 蛋白仅能与PEDV 阳性血清反应，与其它几种病毒阳性血清均无交叉反应(图4)。表明本研究建立的间接ELISA 方法具有较强的特异性。

图4 间接ELISA 特异性试验Fig.4 Specificity test of the indirect ELISA

2.6 敏感性试验结果利用建立的间接ELISA 方法对2 倍倍比稀释的PEDV 阳性血清进行检测，结果显示当阳性血清400 倍稀释时其PR 值仍大于26.5，为阳性(图5)，而当该阳性血清800 倍稀释时，其PR 值25.9 小于26.5，结果为阴性，因此该间接 ELISA 的敏感性为 1 ∶400。表明所建立的ELISA 方法具有较高的敏感性。

图5 敏感性试验结果Fig.5 Sensitivity test of the indirect ELISA

2.7 重复性试验结果利用建立的IgA 抗体间接ELISA 方法，选取6 份临床已知的阳性、弱阳性和阴性血清分别进行批内和批间重复性试验，对结果进行统计学分析。结果显示，批内和批间重复变异系数均小于10 % (表2)。表明本研究建立的间接ELISA 方法具有较好的重复性。

2.8 临床样品的检测结果分别用建立的ELISA方法和IFA 对黑龙江、河南、山东等地的142 份猪血清进行检测，以IFA 为标准，计算间接ELISA 与IFA 的符合率。结果显示，IFA 共检出57 份阳性血清，间接ELISA 方法共检出55 份阳性血清， IFA检出85 份阴性血清，间接ELISA 方法共检出87 份阴性血清。经计算间接ELISA 方法和IFA 的阳性符合率为96.5 %，阴性符合率为100 %，总符合率为98.6 % (表3)。表明本研究建立的间接ELISA 方法可以用于临床样品检测。

表2 间接ELISA 重复性试验(n=6)Table 2 Repeatability assay for indirect ELISA (n=6）

表3 间接ELISA 方法与IFA 对临床样品的检测结果Table 3 Comparisons of the detection result of iELISA and IFA

3 讨 论

目前G2 型PEDV 广泛流行，主要侵害猪的小肠组织，引起严重的腹泻症状，基于肠道局部黏膜免疫的特点，IgA 抗体在该过程中发挥重要的作用，IgA 抗体水平的变化与疾病的进程和机体的抗病毒能力具有相关性[9,11,13]。研究表明针对PEDV S1 蛋白的特异性IgA 抗体与机体免疫水平具有相关性[6,13]。基于以上的理论基础，本研究以G2 型PEDV S1 蛋白为诊断抗原建立了特异性IgA 抗体间接ELISA 检测方法，通过该方法能够有效地反映临床PEDV 的感染水平和免疫水平。

虽然基于PEDV 的S 蛋白、N 蛋白和M 蛋白作为包被抗原均能用于ELISA 方法的建立，但是S1蛋白具有多个中和表位，是刺激机体产生PEDV 特异性中和抗体的重要靶蛋白[6]。因此，本研究构建了重组质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc，并利用真核表达系统获得了具有双重功能的融合蛋白LNCT2-S1-Fc，不仅具有S1 蛋白的功能，还引入了人源IgG Fc 片段，利于蛋白胞外分泌表达和纯化[17]，并通过商品化亲和层析柱获得高纯度、高浓度的目的蛋白。Western blot 结果显示蛋白条带单一，表明该融合蛋白特异性良好、生物活性高。由于真核表达系统能够对蛋白进行翻译后修饰[16]，因此所获得的蛋白大小大于预期S1 蛋白与Fc 蛋白的总和，其可以为后续ELISA 抗原包被及其它试验提供真核细胞修饰的S1 蛋白。

本研究以纯化的S1 蛋白作为包被抗原，以羊抗猪IgA-HRP 作为二抗，采用方阵滴定法对ELISA 反应条件进行了的优化，最终确定了IgA 间接ELISA检测方法最佳的操作条件和步骤。根据临床上广泛采用的临界值判定方法确定了该检测IgA 抗体间接ELISA 方法的阴阳性临界值，并依次对该方法进行了特异性、敏感性和重复性试验。特异性试验显示该间接 ELISA 方法对 PDCoV、TGEV、PoRV 和PCV2 阳性血清无交叉反应，以PEDV-S1-Fc 融合蛋白为诊断抗原具有较强的特异性，为鉴别检测PEDV IgA 抗体阳性样品提供了可行的方法。敏感性试验与重复性试验表明该方法具有良好的敏感性和重复性。对现地血清样品的检测结果显示，间接ELISA 方法与IFA 总符合率高达98.6 %。同时，IgA 抗体在机体免疫保护过程中发挥着重要的作用，因此，本研究建立的IgA 抗体间接ELISA 检测方法能够作为临床样品检测和机体免疫保护水平监测的有效方法。