致蛋鸡卵黄性腹膜炎大肠杆菌分子分群、耐药表型及耐药基因型检测与分析

张召兴，李佩国，李蕴玉，贾青辉，张香斋，吴同垒，张志强

(1.河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛066604；2.河北旅游职业学院畜牧兽医系，河北承德067000)

鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌(PathogenicEscherichia coli，E.coli)引起的鸡败血症、脐炎、气囊炎、卵黄腹膜炎等一系列疾病的总称，是危害蛋鸡养殖业的主要细菌性传染病之一[1-2]。卵黄性腹膜炎主要发生于高产蛋鸡，引起蛋鸡生产性能下降、消瘦，还可以继发其它疾病，严重者可造成急性死亡，尤其是高产蛋鸡卵黄性腹膜炎发病死亡率较高并导致种蛋受精率和出雏率下降，成为蛋鸡生产中最常见的传染病之一，给蛋鸡养殖业造成严重经济损失[3-4]。致病性E.coli拥有多种血清型，同一血清型中不同的菌株无交叉免疫保护性，给致病性E.coli疫苗的研制带来一定的困难，是导致大肠杆菌病广泛流行的主要原因之一[5]。抗菌药物是控制大肠杆菌病的主要手段，但由于抗菌药物大量不合理使用导致E.coli耐药基因发生变异，改变其耐药机制，致使E.coli耐药菌株不断出现，并使其产生广谱的耐药性，同时也造成蛋、肉等畜产品中的抗菌药物残留，威胁人类的健康，导致公共安全卫生问题的产生[6]。因此，在蛋鸡养殖过程中应注意抗菌药物的合理使用。

2015年～2018年本研究室从邢台和秦皇岛地区蛋鸡养殖场中分离到了42 株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli。本实验对临床分离的42 株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli分离株的系统进化分群、12 种抗菌药物耐药表型和耐药基因进行检测，并分析耐药表型和耐药基因型之间的相关性，为致蛋鸡卵黄性腹膜炎大肠杆菌的防控及临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌 株2015年～2018年从邢台和秦皇岛地区不同的蛋鸡养殖场患病的40 周龄～50 周龄产蛋鸡肝脏、卵黄等组织中分离到的42 株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli以及E.coli参考菌株ATCC25922 均由河北省预防兽医学重点实验室保存。

1.2 主要试剂普通营养肉汤购自青岛高科园海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、DNA 回收试剂盒等均购自OMEGA 公司；ExTaqDNA 聚合酶购自TaKaRa 公司；DL2000 DNA Marker 购自北京中科瑞泰生物科技公司；96 孔细菌培养板购自美国Corning 公司；阿莫西林 - 克拉维酸(A/C)、头孢曲松(CRO)、头孢噻呋(EFT)等11 种抗菌药物购自河北远征生物工程有限公司；美罗培南(MEM)购自上海宸功生物技术有限公司。

1.3 分离菌系统进化分群鉴定参考文献[7]设计E.coli系统进化分群引物即分别扩增chuA、yiaA和TspE4.C2基因的引物(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。利用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取42 株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli分离株基因组DNA，以其为模板， 采用三重PCR 扩增分离菌菌株的chuA、yiaA和TspE4.C2基因，判定分离菌株的系统进化群。

1.4 分离菌的最小抑菌浓度(MIC)及其耐药性检测参考文献[8]，采用96 孔板微量肉汤稀释法测定临床分离的42 株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli对12 种常用抗菌药物的体外MIC，并用E.coli参考菌株ATCC25922 作为质控菌株，参照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的药敏试验操作方法和标准，对12 种常用抗菌药物MIC 值的结果进行判定[9]。将临床分离的42 株E.coli培养至对数期并计数，调整菌液浓度为108cfu/mL，取100 μL 菌液，接种于含不同药物浓度的96 孔细菌培养板中，同时设阴性对照、阳性对照，37 ℃恒温培养24 h，观察结果。计算分离菌株对药物的 MIC50、MIC90及MIC 值，并统计分离菌株对12 种抗菌药的耐药率(包括中介)和耐药表型。

1.5 细菌耐药基因的检测根据临床分离的42 株E.coli的耐药表型，扩增分离菌株的相应的耐药基因。根据GenBank 中登录的E.coli耐药基因序列和文献报道，设计各耐药基因的引物[10]：TEM、SHV、CTX-M(ESBLs 类)，MOXACC、DHA(头孢菌素类)，NDM(碳青烯酶类)，Sul1、Sul2(磺胺类)，aac(3)-Ⅰv、aac(6')-Ⅰb(氨基糖苷类)，gyrA、gyrB、qurS(喹诺酮类)，TetA、TetR(四环素类)，floR(酰胺醇类)，mcr-1(多肽类)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以1.3 提取的分离菌株的基因组DNA 为模板对上述耐药基因进行PCR 扩增，将PCR 产物回收后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定，测序结果采用NCBI-BLAST 比对，鉴定标准按照同源性≥97 %判定。

1.6 细菌耐药表型与耐药基因相关性分析采用统计学软件SPSS19.0 对临床分离的42 株E.coli的耐药表型及耐药基因型进行统计，并分析42 株分离菌株的耐药表型和耐药基因型之间相关性，计算二者的符合率。

2 结 果

2.1 分离菌株系统进化分群检测结果利用大肠杆菌分子分群的chuA、yiaA和TspE4.C2基因进行三重PCR 扩增方法检测临床分离株的系统进化分群情况。结果显示，42 株分离菌株中，7 株属于A 群、9 株属于 B1 群、14 株属于 B2 群、12 株属于 D 群，分别占分离菌株的16.67 %、21.43 %、33.33 %、28.57 %，其中A+B1 群占分离菌株的38.10 %，B2+D 群占分离菌株的61.90 %。表明临床分离的42株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli分离株以B2+D 群流行为主。

2.2 分离菌株耐药表型检测结果采用96 孔板微量肉汤稀释法测定临床分离的42 株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli对 12 种常用抗菌药物的 MIC，统计其MIC50、MIC90，分析其耐药性。结果显示，42 株分离菌株对阿莫西林- 克拉维酸、磺胺间甲氧嘧啶、多西环素、多黏菌素4 种药物耐药率较高，耐药率在80.95 %～100 %；对氟苯尼考、丁胺卡那、大观霉素、环丙沙星、恩诺沙星5 种药物的耐药率为45.24 %～76.19 %；对头孢曲松、头孢噻呋、美罗培南3 种药物的耐药性相对较低，为19.04 %～38.10 % (表2)，表明临床分离的42 株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli分离株耐药性严重。

表2 致鸡卵黄性腹膜炎E.coli 分离菌株耐药性检测结果Table 2 Drug resistance test of E.coli isolates causing salpingo peritonitis in layer chicken

临床分离的42 株E.coli中，耐12 种抗菌药物的有8 株、耐11、3 种抗菌药物各4 株、耐10、2、1 种抗菌药物各2 株、耐9 种抗菌药物有7 株、耐8、6 种抗菌药物各有1 株，耐7 种抗菌药物5 株，耐5 种抗菌药物有6 株，耐12、9 种抗菌药物的分离菌株最多，分别占分离菌株的19.05 %、16.67 %(表3)。表明分离菌株呈现多重耐药性。

2.3 分离菌株耐药基因检测结果采用PCR 的方法对临床分离的42 株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli分离株的18 种耐药基因进行检测。结果显示，42 株E.coli分离株中检出15 种不同的耐药基因，检出率为 83.33 % (15/18)，其中耐药基因tetA、Sul1、TEM、Sul2、mcr-1、floR、SHV、tetR检出率较高，为 59.52 %～95.24 %；耐药基因aac(6')-Ⅰb、qurS、aac(3)-Ⅰv、gyrA、MOX、ACC检出率相对较低，为14.29 %～38.10 %；NDM、DHA、CTX-M3 种耐药基因未检出，上述耐药基因测序结果与GenBank参考株相应基因序列同源性为97.9 %～99.9 % (表4)。表明15 种不同的耐药基因广泛分布于42 株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli分离株中。

表3 致鸡卵黄性腹膜炎E.coli 分离菌株耐药表型分析结果Table 3 Phenotypic analysis of drug resistance of the E.coli isolates causing salpingo peritonitis in layer chicken

表4 致鸡卵黄性腹膜炎E.coli 分离菌株耐药基因的检测结果Table 4 Detection of resistance genes in E.coli isolates causing salpingo peritonitis in layer chicken

2.4 分离菌株耐药表型和耐药基因型相关性分析结果采用统计学软件SPSS19.0 对临床分离的42 株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli分离株的耐药表型和耐药基因型之间进行了相关性分析。结果显示，磺胺类、酰胺醇类、多肽类的耐药表型和耐药基因型符合率最高，为97.5 %、100 %、100 %；四环素类、ESBLs 类、头孢菌素类的耐药表型和耐药基因型符合率在58.3 %～81.8 %之间；喹诺酮类中耐药表型和gyrA+qurS耐药基因型符合率为52.6 %，与gyrA+gyrB及gyrA+gyrB+qurS耐药基因型符合率比较低，氨基糖苷类的耐药表型和耐药基因型符合率较低(表5)。表明临床分离的42 株E.coli的耐药表型和耐药基因型之间存在一定相关性。

3 讨 论

E.coli是重要人畜共患病原，根据其遗传特点和临床致病型特征分为肠外致病性大肠杆菌(Ex PEC)、肠内致病性大肠杆菌、共生型大肠杆菌3 个类型，禽致病性大肠杆菌(APEC)属于ExPEC，APEC 是危害蛋鸡养殖主要的传染病病原，尤其是对产蛋高峰期的蛋鸡[1-2,11]。E.coli可以分为A、B1、B2、D 4 个系统进化群，许多相关研究表明了E.coli的B2 和D 群是主要致病群。诸葛祥凯等报道了APEC 和人肠道外大肠杆菌分离菌株多属于B2 群[12]。Matija 等报道E.coli的D 群是主要致病群[13]。王明城等报道了分离的肠外大肠杆菌分离菌株以B2 群为主要的流行菌群，其毒力强于其它菌群[14]。本实验结果显示，临床分离的42 株致鸡卵黄性腹膜炎E.coli分离株以B2+D 群流行为主，与上述报道一致。

表5 致鸡卵黄性腹膜炎E.coli 分离菌株耐药表型和耐药基因型相关性分析结果Table 5 Correlation analysis of drug resistance phenotype and genotype of E.coli isolates causing salpingo peritonitis in layer chicken

由于E.coli对抗菌药物易产生耐药性被认为是耐药决定因子的“贮藏库”，E.coli基因组中编码的耐药质粒可以通过接合、转化、转导等多种方式在不同血清型菌株之间传播，使抗菌药物敏感菌株成为耐药菌株，耐药质粒可以通过主动外排系统、整合子/ 基因盒系统改变E.coli细胞膜的通透性，致使抗菌药物难以进入细胞靶位，因而导致多重耐药性E.coli的产生[12-13]。因此，对E.coli耐药表型检测尤为重要。本实验研究显示42 株分离菌株对阿莫西林- 克拉维酸、磺胺间甲氧嘧啶、多西环素等9种药物耐药率在45.24 %以上，对头孢曲松、头孢噻呋、美罗培南3 种药物的耐药性相对较低，耐12种、9 种抗菌药物分离菌株最多。从而证实了邢台和秦皇岛地区分离的致蛋鸡卵黄性腹膜炎E.coli的耐药性呈现严重多重耐药性。美罗培南是碳青霉烯类抗生素。主要用治疗多重耐药革兰阴性菌感染，但42 株分离菌株对其也产生了耐药性。与于静晨等[13]、刘璨颖等[14]、贾青辉等[15]报道存在一定的差异性。可能由于不同地区的E.coli菌株用药情况和遗传特性不同，导致耐药种类的差异性。

E.coli编码的耐药基因主要位于质粒和转座子等可移动基因元件中，质粒中携带的许多不同耐药基因，在抗菌药物对细菌产生选择压力时，致使E.coli耐药基因发生变异，从而导致细菌耐药性的产生和扩散[15]。因此，耐药基因在细菌耐药性中起着重要的作用。本研究耐药基因检测结果显示，42株分离菌株中耐药基因tetA、Sul1、TEM、Sul2、mcr-1、floR、SHV、tetR检出率在59.52 %以上，其它耐药基因检出率14.29 %～38.10 %，其中多肽类、酰胺醇类、四环素类等7 类抗菌药物的耐药表型和耐药基因型符合率在52.6 %以上，其中酰胺醇类、多肽类的耐药表型与耐药基因型的符合率为100 %。多肽类、酰胺醇类、四环素类等7 类抗菌药物耐药基因在受试耐药菌株中检出率较高，因而证实了E.coli编码的耐药基因在受试菌株的耐药性中起着重要的作用。与于静晨等报道江苏、安徽等地分离的53 株APEC 耐药基因与相关耐药菌株检出率基本呈正相关一致[13]。本实验中氨基糖苷类耐药表型和耐药基因型符合率为33.3 %，相对较低，可能由于氨基糖苷类耐药基因编码氨基糖苷类修饰酶的aac(3)-Ⅰv和aac(6')-Ⅰb基因不是导致耐氨基糖苷类耐药性的主要因素，可能还存在其它耐药机制。相关研究表明多黏菌素是治疗革兰阴性菌引起肠道感染的首选药，被喻为“抗生素最后一道防线”，对多黏菌素产生的耐药是由耐药基因mcr-1介导的，其可以在不同种属菌株之间转移与传播[16]。本实验中多黏菌素耐药表型和耐药基因符合率为100 %，表明多黏菌素耐药性及耐药基因mcr-1广泛存在于致鸡卵黄性腹膜炎E.coli分离株中。张莱民也报道了养鸡业中大量使用多黏菌素引起E.coli耐药基因mcr-1在肉鸡产业链中的广泛传播[17]。耐药基因floR主要由质粒介导大肠杆菌对氟苯尼考的耐药性，其可以传递给其它动物和人类[18]。本实验分离的E.coli分离株对氟苯尼考产生很强的耐药性，与其耐药基因floR的符合率为100 %，表明分离菌株对氟苯尼考的耐药性是由耐药基因floR介导的，其是否能够在其它菌株之间传播还有待进一步研究。因此，在蛋鸡养殖过程中应该重视抗菌药物的使用，注意休药期，减少相关抗菌药物耐药性的转移与传播。本实验为致蛋鸡卵黄性腹膜炎大肠杆菌病防控及临床用药提供了参考。