湘华鲮一种急性细菌性肠炎的病原分离及组织病理研究

蒋国民，邓时铭，邹 利，程小飞，李传武，刘 丽*

(1.湖南省水产科学研究所，湖南长沙 410153；2.湖南省水产原种场，湖南长沙 410153；3.湖南省水产高效健康生产协同创新中心，湖南常德415000)

湘华鲮[Sinilabeodecorustungting(Nichols)]属于鲃亚科(Barbinae)华鲮属(Sinilabeo)，是沅水流域重要的名贵鱼类之一[1]，为湖南省特有品种，具有肉质细美、营养价值高等优良特性[2]。近几十年来，湖南省水产科学研究所一直致力于研究湘华鲮的人工繁养技术，已突破人工繁殖和驯食技术难关[3]，获得大批量鱼苗，目前正在开展规模人工养殖试验。在养殖过程中，湖南省水产科学研究所自繁自养的50 月龄湘华鲮出现大量死亡，病鱼鳃丝粘液增多，鳍条基部充血发红，肛门红肿。解剖发现，腹腔积水，肝脏颜色变淡，肠壁弹性差、易断，肠道内有大量白色粘液，死亡率可达100 %，而同一池塘的鲢鱼、鳙鱼、草鱼、鲫鱼均不发病。为了尽快查明发病死亡的病原菌，本研究对病死鱼进行病原菌的分离纯化，结合微生物形态与理化特征、常规生化鉴定和PCR 鉴定方法进行纯化菌种的鉴定，并经药敏试验筛选出最佳治疗药物；通过观察病鱼肝胰脏和肠道组织切片，比较分析该病的病理组织变化，以期为该病的临床诊断和防控提供实验依据，以丰富湘华鲮细菌性病害研究资料。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料患病鱼为湖南省水产科学研究所自繁自养的50 月龄湘华鲮，规格为350 g～400 g/尾。健康湘华鲮(人工感染试验)为38 月龄，体重120 g～180 g/ 尾。标准药敏纸片购自杭州微生物制剂有限公司；细菌基因组DNA 抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；霍乱弧菌O1、O139诊断血清试剂盒购自天津生物芯片有限公司。

1.2 分离菌形态观察与生化鉴定无菌条件下，采集患病湘华鲮的腹水和肠道粘液，分别接种于普通营养琼脂平板上，28 ℃恒温培养18 h～24 h，选择典型优势可疑的单个菌落纯化培养，4 ℃保存备用。挑取纯化菌株进行革兰氏染色和一系列过氧化氢酶、硫化氢、甲基红等生理生化特性鉴定，结合常见细菌系统鉴定手册[4]、伯杰细菌鉴定手册(第9 版)[5]进行分离菌的初步判断。

1.3 人工感染试验对室内小水泥池暂养10 d 的健康湘华鲮进行感染试验，随机分成3 组，每组20尾，每组设一平行。1.2 分离的菌株XHL-03 在28 ℃恒温培养18 h～24 h，用无菌生理盐水，制成细菌悬浊液，根据麦氏比浊管确定菌液约为3.0×107cfu/mL、3.0×106cfu/mL，前两组腹腔注射以上2 种浓度菌液，每尾0.5 mL，对照组注射相同体积生理盐水。试验期间每天可适量投喂，连续观察7 d，并对濒死湘华鲮进行细菌分离。

1.4 分离菌的16S rDNA 序列分析按照细菌基因组DNA 提取试剂盒说明方法提取1.2 中分离的菌株总 DNA，以 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/1492R： 5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3' 为引物进行PCR 扩增，采用DNA 纯化回收试剂盒纯化回收16S rDNA 产物，由铂尚生物技术(上海)有限公司测序。所得 16S rDNA 序列在 NCBI 的 Gen-Bank/Blast 中进行同源性比对分析。通过ClustalW、DNAstar 和Mega4 等软件，采用邻接法(Neighbour-Joining method)构建系统发育树。

1.5 病原菌血清型鉴定采用霍乱弧菌O1、O139血清诊断试剂盒进行病原菌霍乱弧菌O1 群、O1(小川)、O1(稻叶)和O139 血清型的鉴定，对照为0.65 %生理盐水。

1.6 病原菌药物敏感试验选取16 种常用药物，采用纸片法进行药敏试验[4]，每种药片重复3 次。试验结果判断按中华人民共和国卫生部纸片法抗菌药物敏感试验标准(WS/T 125)进行。

1.7 湘华鲮消化道组织病理切片观察无菌条件下，取健康湘华鲮和患病湘华鲮的肝脏、胰脏和中间肠道组织制作常规病理切片[6]，光学显微镜下拍照观察，比较分析患病湘华鲮组织病理变化。

2 结 果

2.1 分离菌的形态特征及生化鉴定结果从患病湘华鲮的腹水和肠道粘液分离获得一纯化菌株，命名为XHL-03。该分离菌接种普通琼脂培养基28 ℃培养24 h，在培养基表面上形成圆形、乳白色、不透明的菌落，表面湿润、光滑，菌边缘光滑。该分离菌经革兰氏染色为阴性，紫红色、可弯曲、两端钝圆长短不一的杆状菌(图1)。表明分离菌XHL-03 为可弯曲的革兰氏阴性杆菌。

经生化鉴定结果显示，菌株XHL-03 能够分解葡萄糖、蔗糖，淀粉等，不分解木糖、肌醇、阿拉伯糖等，MR 试验、吲哚试验阳性，VP 试验阴性(表1)，结合细菌表型特性和生理生化特性可初步判断分离菌为霍乱弧菌(Vibrio cholera)[5]。

图1 革兰氏染色后的细菌形态Fig.1 The micrograph showing Grarm staining of the isolate XHL-03 (1 000×)

表1 分离菌生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the bacterial isolate

2.2 分离菌的人工感染试验注射分离菌XHL-03菌液，感染健康湘华鲮，第2 d 开始其出现游动迟缓、背鳍基部充血、肛门红肿、食欲下降等症状，实验鱼陆续死亡。3.0×107cfu/mL 浓度组菌液感染湘华鲮后3 d 内全部死亡，发病率达到100 %；3.0×106cfu/mL 浓度组感染湘华鲮后5 d 内，死亡率达55 % (表2)；解剖感染后死亡的湘华鲮，可见其肝胰脏颜色略白，肠道粘膜红肿，肠腔内有白色粘液，与自然发病症状相似。对照组未出现异常症状，吃食正常。取人工感染的湘华鲮再次进行病原菌分离，获得了与XHL-03 形态、理化特性一致的菌株，表明菌株XHL-03 具有致病性，为湘华鲮死亡的病原菌。

2.3 16S rDNA 基因序列测定与系统发育学分析以提取的分离菌XHL-03 基因组总DNA 为模板，PCR 扩增其16S rDNA 基因序列。产物纯化回收后直接用于测序分析，测得该16S rDNA 基因序列长度 1 392 bp，其 GenBank 登录号为 MK615861。通过NCBI 中Blast 在线比对分析，结果显示XHL-03菌株 16S rDNA 基因序列与霍乱弧菌 RC483 株(EF684899.1)相应基因序列同源性最高，达97 %～99 %，构建其系统发育树。结果显示，XHL-03 菌株与霍乱弧菌的亲缘关系最为接近(图2)。综合常规生化鉴定，进一步表明本研究获得的XHL-03 菌株为霍乱弧菌。

表2 人工感染试验结果Table 2 Results of artificial infection test

图2 分离菌株XHL-03 及相关菌株16S rDNA 基因序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the XHL-03 isolate and its relatives based on 16S rDNA gene sequences

2.4 病原菌的血清型鉴定结果通过霍乱弧菌O抗原玻片凝集试验，结果显示分离菌XHL-03 与霍乱弧菌O1 群、O1 群稻叶型、O1 群小川型、O139诊断血清均不发生凝集反应(表略)，表明该菌株XHL-03 属于非O1/非O139 群霍乱弧菌。

2.5 病原菌的药敏试验结果药敏试验结果显示，本实验分离的霍乱弧菌XHL-03 菌株对青霉素、氨苄西林、万古霉素等耐药，对头孢拉啶为中度敏感，对其它10 种药物均为高度敏感(表3)。10 种高度敏感药物可以有效地抑制其生长增殖，为养殖生产上防控该病的可选药物。

2.6 发病湘华鲮消化道病理组织学变化患病湘华鲮的消化道组织呈现不同的病理变化：肝脏动脉血管管壁增厚，管腔缩小(图3A)；静脉血管淤积大量血细胞，管壁脱离、破裂(图3B)；毛细血管扩张，肝血窦充血，肝组织中可见大量红细胞(图3C)；肝细胞索模糊，胞核核仁固缩，胞膜消失，胞质流失，细胞缩小、形状多样，细胞分界不清(图3A)。胰腺弥散分布于肝脏中，间质纤维组织减少，有炎性细胞浸润，腺泡细胞膜模糊，酶原颗粒少，胞核肿大，核仁固缩并逐步解体，核仁膜变粗(图3E)。肠道粘膜有大量淋巴细胞浸润并穿肠而出，固有层血细胞淤积(图3G)；粘膜下层、静脉血管有少量淤血，有充血的小结节(图3H)。表明，患病后的湘华鲮有急性胰腺炎和肠炎的综合病理症状。

表3 药物敏感性试验结果Table 3 Results of drug sensitivity test

3 讨 论

通过常规分离纯化获得XHL-03 菌株，经人工感染试验鉴定为致病菌。经形态学观察、生化试验、16S rDNA 基因测序比对及系统发育树聚类和血清凝集试验，分离菌XHL-03 株为非O1/ 非O139 霍乱弧菌，为一种烈性肠炎的病原菌[7]。它侵入湘华鲮体内，促使其肠道收缩，诱导机体排出肠道有益微生物[8]，然后定植于肠道上皮组织，引起肠道大量淋巴细胞浸入肠腔，导致炎症现象十分明显。同时致使发病湘华鲮肝脏充血，肝细胞解体，弥散分布于肝脏中的胰腺酶原颗粒减少，腺泡细胞出现不同程度的坏死，炎性细胞增加，呈现急性胰腺炎的病理症状[9]。由此可见，湘华鲮非O1/ 非O139 霍乱弧菌急性肠炎疾病会并发肝胰脏器官功能障碍，导致急性胰腺炎的发生。

图3 湘华鲮消化道组织病理特征Fig.3 Histopathology features of digestive tract tissues in infected Sinilabeodecorustungting

霍乱弧菌广泛存在于自然环境中，为水体的天然居民[10]，以生物膜的形式抵抗不良环境[11]，偏嗜富营养化的碱性养殖水体[12]，能够感染水产动物引起泥鳅[13]、黄金鲫[14]、草鱼[15]等鱼类大量死亡。而非O1/ 非O139 霍乱弧菌感染人工养殖的湘华鲮时，同一池塘草鱼、鲫鱼等不发生感染，导致该现象的发生可能是喜生活在略偏碱性(pH7.6±0.3)水体[16]的湘华鲮较同一池塘、早已适应人工养殖环境的草鱼、鲫鱼对本研究的非O1/ 非O139 霍乱弧菌更为敏感。同时人工养殖条件下，湘华鲮摄食习性改变，摄食量显著增加，消化系统负担过重，肠道菌群易紊乱，机体免疫系统受到的不良影响较同一池塘的草鱼、鲫鱼强烈，因此较易受到非O1/非O139霍乱弧菌的侵袭。

就目前我国水产养殖行业，细菌性疾病的防控还是以抗生素药物。因此，本实验测定16 种药物对湘华鲮源非O1/ 非O139 霍乱弧菌的抑制能力，结果显示诺氟沙星、呋喃唑酮、头孢噻肟、头孢曲松等10 种药物均能显著地抑制该病原菌的生长，使其对这几种药物呈现高度敏感性。但由于诺氟沙星、呋喃唑酮为我国食用动物养殖中禁用药物。因此，湘华鲮养殖过程中可选择头孢噻肟、头孢曲松、新霉素等8 种敏感药物进行防治，可有效地控制本研究的非O1/ 非O139 霍乱弧菌引起的急性肠炎。